重组腺病毒pAd-BMP7转染大鼠骨髓MSCs及骨向分化的研究

重组腺病毒pAd-BMP7转染大鼠骨髓MSCs

及骨向分化的研究

戚孟春1，胡静2，邹淑娟2，王大章2，李继华2

1. 河北唐山华北煤炭医学院口腔系(063000) 2. 成都四川大学华西口腔医学院(610041)

E-mail: drhu@vip.sohu.com

摘 要：目的 本研究旨在观察骨形成蛋白-7（BMP-7）重组腺病毒对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）骨向分化的影响，并检测BMP-7在MSCs中的表达。方法 测定重组腺病毒pAd-BMP7的滴度。将MSCs分成实验和对照2组，分别转染pAd-BMP7和空白载体pAdTrack-CMV，检测外源基因转染效率，并在骨向诱导下观察细胞矿化结节形成情况。应用RT-PCR、免疫细胞化学手段进一步检测BMP-7在MSCs中的表达。结果 重组腺病毒pAd-BMP7的滴度可达2.0×10 pfu/ml；外源基因的转染效率接近100%，表达时间持续5~7周，3周内表达水平较高。转染BMP-7的实验组体外矿化结节形成早于对照组，结节的数目和体积均较对照多。RT-PCR和免疫细胞化学检测证实了BMP-7在大鼠MSCs中的有效表达。 结论 本研究结果提示BMP-7重组腺病毒可有效转染大鼠骨髓MSCs，并促进其骨向分化；转染的BMP-7得到了有效表达。本研究采用的基因工程策略为颅颌面骨缺损的修复提供了一个有价值的手段。 关键词：骨形成蛋白-7；腺病毒；基因克隆；间充质干细胞，骨向分化

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1. 引 言

颅颌面部骨缺损的修复和再造目前仍然是口腔颌面外科医师面临的巨大挑战。随着现代分子生物学和细胞培养技术的进步，基于骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的基因增强的骨组织工程技术在这一领域越来越显示出巨大的潜力，并被逐步用于各种骨组织缺损的修复和重建。

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）属TGF-β超家族，是目前已知的对骨组织再生作用最强的一类生长因子。在胚胎发育中，BMPs对骨组织形成具有重要的调节和促进作用；外源性BMPs也被证实可有效促进骨折愈合和骨缺损的修复。由于重组BMPs生物活性半衰期短，体内容易流失，因而直接应用效果并不理想。本研究旨在通过构建的BMP-7腺病毒重组质粒，观察重组病毒转染大鼠骨髓MSCs后细胞骨向分化情况，并对BMP-7基因表达进行检测，为应用基因增强的骨组织工程手段修复颅颌面部骨缺损奠定实验基础。

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2. 材料和方法

2.1．主要材料和设备：腺病毒pAdTrack-CMV、pAdEasy-1（QUANTUM，USA）；α-MEM、

USA)；感受态E.Coli BJ5183和DH5α、RNA PCR Kit FBS、LipofectamineTM2000(Invitrogen，

[基金项目] 高校博士点基金（20020610062）与国家自然科学基金（30371553）资助项目

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(AMV) Ver. 2.1、质粒提取试剂盒（TaKaRa，Japan）；人肧肾293细胞株，四川大学华西医院眼科实验室提供；兔抗鼠BMP-7单克隆抗体（SANTA CRUZ, USA）；荧光显微镜(Nikon， Japan）；CO2孵箱 （SanYo，Japan）。

2.2 Adv-EGFP-BMP7的构建：重组质粒pAd-BMP7由四川大学华西医院眼科实验室构

建。方法参见文献[3]：用自行设计的引物从大鼠肾脏中提取BMP-7基因，全长1293bp，并经上海生工测序证实。将大鼠BMP-7基因亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中（携带绿色荧光蛋白基因-GFP），形成重组质粒pAd–CMV-BMP7；随后将pAd–CMV-BMP7和辅助载体pAdEasy-1线性化，电传孔共转化感受态BJ5183和E. Coli DH5α，通过同源重组形成腺病毒重组质粒pAd-BMP7。最后，将所获pAd-BMP7通过脂质体转染293细胞，包装产生腺病毒，并大量扩增；收集细胞，反复冻溶，收集上清液，-80℃保存备用。

2.3病毒滴度测定：分别用OD法和GFP法计算。OD法是将15µl纯化好的病毒用0.435ml

另外用0.435ml H2O稀释15µl高密度CsCl母液作为空白对照，在260nm检测OD值，H2O稀释，

按1012VP/OD260进行换算。GFP法是将病毒液进行不同比例的稀释，取0.5ml稀释液加入 25cm2培养瓶培养的293细胞中，37℃吸附30分钟，更换新鲜培养基，继续培养36小时，荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度(pfu/ml)=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5ｍｌ计算。

2.4重组腺病毒质粒转染大鼠MSCs：分离培养大鼠骨髓MSCs[4]，并于6孔板内制备细

胞爬片。细胞转染分为2组：A组为实验组，将100µl纯化的pAd-BMP7病毒上清液加入每孔MSCs细胞中；B组为对照组，在MSCs细胞中加入100µl空白载体病毒pAdTrack-CMV的上清液。细胞于37℃条件下培养12小时，更换新鲜培养基，继续培养。

2.5病毒对MSCs转染效率的测定：转染2d后，于荧光显微镜下观察2组细胞内荧光

（GFP）表达情况；并分别测定转染后2d、7d、14d、21d和28d EGFP的转染/表达效率，按转染/表达效率（%）=（GFP阳性细胞数/所测细胞总数）×100%计算。

2.6体外骨向分化观察：矿化结节的形成是成骨细胞体外成骨能力的一个重要指标。为观

察BMP-7促进MSCs骨向分化的能力，将转染后的2组细胞在含有骨化诱导液的培养基中继续培养；骨向诱导液为内含10%（v/v）FBS、10nmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05mmol/L抗坏血酸的α-MEM 。每周在显微镜下观察细胞形成矿化结节的情况，并行茜素红染色。取细胞爬片，PBS冲洗，95%乙醇固定10min，蒸馏水冲洗3次；0.1%茜素红-Tris-Hcl (PH8.3)37℃孵育30min；蒸馏水冲洗，干燥，加拿大树胶封片；显微镜下观察。染色鲜红的部位即为矿化结节。

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2.7目的基因BMP7在MSCs中表达的检测：细胞转染2d后，收获2组细胞。提取

细胞总RNA；并用设计的上下游引物，通过RT-PCR法检测BMP7基因的表达。同时将2组细胞爬片用丙酮固定，通过免疫细胞化学方法检测BMP-7蛋白的表达。所用一抗为兔抗鼠BMP-7单克隆抗体 (1:100)，二抗为羊抗兔IgG(1:200)。用PBS代替一抗，作为阴性对照。

2.8统计分析：应用统计软件SPSS10.0进行独立样本的t检验。

3. 结 果

3.1重组病毒pAd-BMP7滴度测定：pAd-BMP7成功构建后，经OD法和GFP法测定，病

毒滴度分别为2.0×1012 pfu/ml 和5.0×1011 pfu/ml；说明病毒感染能力强。

3.2病毒转染MSCs后GFP的表达：实验组和对照组MSCs分别转染pAd-BMP7和

pAdTrack-CMV后，于24h开始表达GFP，在荧光显微镜下表现为胞浆为绿色；最高表达为2~5d，以后表达逐渐减弱，最长可持续5~7w（图1A-D）。转染后2d、7d、14d、21d和28d，实验组GFP的转染/表达效率分别平均为98.53%、85.74%、65.33%、41.56%和22.15%；对照组转染/表达效率与实验组相似，分别为99.13%、86.05%、64.72%、43.44%和23.55%；两组经统计学分析差异无显著性（p>0.05）。

相差显微镜×100；B和D，荧光显微镜×100

图1 pAd-BMP7转染实验组MSCs 2d (A和B)和14d(AC和D)后GFP的表达。A和C，

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图2 转染后3w 实验组（A和B）和对照组（C和D）MSCs的体外骨向分化。A和C，

荧光显微镜×100；B和D，相差显微镜×100

3.3转染后MSCs体外骨向分化的观察：经骨向诱导液诱导，2组细胞增殖加速，并呈

集落性生长；诱导后2w，两组细胞均开始有矿化结节形成，表现为细胞呈簇状分布，中心为颗粒状无定形物质；其中实验组形成的矿化结节数目较多，体积较大。诱导后3w，实验组形成的矿化结节更为明显，中央为大量颗粒状矿化物，荧光显微镜下表现为强的绿色荧光，茜素红染色表现为鲜红色（图2A、2B）；而对照组矿化结节形成较小，绿色荧光和茜素红染色均较浅（图2C、2D）。

4．BMP-7在MSCs中表达的检测：转染后实验组MSCs经免疫细胞化学检测，几乎所有细胞表现为BMP-7表达阳性，阳性率约为99% (图3)；而对照组细胞则为BMP-7阴性。提示目的基因BMP-7在实验组MSCs中得到了有效表达。

两组细胞的总RNA经RT-PCR扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，只有实验组细胞在约1.3kbp处有一特异性扩增条带，提示有目的基因转录；而对照组细胞，未见目的基因的特异性扩增条带 (图4)。

图3 免疫细胞化学检测BMP-7在实验组MSCs中的表达(×100)

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图4 RT-PCR法检测BMP-7在MSCs中的表达. Lane 1和2, 实验组; Lane 3和4, B对照组

4. 讨论

基因增强的骨组织工程技术是目前骨缺损修复最具潜力的手段之一。该方法是将基因工程和组织工程相结合，通过将促成骨基因导入到载体细胞内（MSCs、成骨细胞等），然后以一定的方式引入骨再生部位，达到促进骨修复的目的。在众多的基因治疗载体中，腺病毒是最常用的转移载体之一。目前所用的腺病毒通常去除了病毒基因组中的E1和E3区，因而处于复制缺陷状态。腺病毒的优点是容易获得较高的滴度，可以转染多种细胞（包括静止期细胞），转染效率高（可达100%）；病毒基因不整合到靶细胞基因组中，因而避免了插入突变的危险[5]。

本研究所用腺病毒pAd-BMP7是由2个腺病毒pAdTrack-CMV和pAdEasy-1同源重组而成，所获病毒滴度达2.0×1012 pfu/ml；以之转染大鼠骨髓MSCs，转染效率接近100%，与国外研究报道相似，且未见明显的细胞毒性反应；该转染效率明显高于我们前期研究中应用脂质体介导的BMP-7对MSCs的转染（载体为pEGFP-N1）；说明该方法用于BMP-7基因治疗是适宜的。同时，本实验所用腺病毒携有报道基因GFP，方便了基因转染的观察和基因表达的原位检测。

基因对细胞的转染分瞬时转染和稳定转染两种[5]。稳定转染是目的基因序列整合到宿主的基因组序列中，可长期表达并发挥作用；该途经适于临床上系统性和遗传性疾患的基因治疗。而在瞬时转染中，目的基因序列并不整合到宿主基因组中，常随细胞的分裂而消失；表达期限一般为数周的时间。由于在骨折的愈合和骨缺损修复中，骨再生主要发生在起始数周内，因而瞬时转染策略更适于在骨组织工程中的应用[6]。本研究中腺病毒介导的转染即瞬时转染，外源基因的表达效率虽时间延长逐渐下降；但在2~3w内，外源基因表达仍维持较高的水平（40-65%）；转染后5~7周仍可见一定量的表达；外源基因的表达和骨再生在时间上具有一致性。

骨形成蛋白（BMPs）是目前发现的对骨组织再生作用最强的生长因子。BMPs以同源或异源二聚体的形式发挥作用；与具有磷酸激酶活性的I型和II型胞膜受体结合，使胞内第二信使Smad蛋白发生磷酸化，并进一步激活胞核内的靶基因，促使其表达[2, 7]。BMPs能够促进

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未分化间充质细胞（MSCs）和成骨细胞（OB）前体增殖，并诱导其向成骨细胞分化；同时对MSCs、OB和内皮细胞具有趋化作用，因而可通过促进它们的募集和血管生成来诱导骨形成[8]。BMPs还可影响多种生长因子和激素的分泌，进一步促进骨再生。研究显示，外源性BMPs可有效促进骨折愈合和骨缺损的修复[2]；最新研究也表明，牵张间隙内有BMPs的特异时空表达，提示BMPs对骨再生的重要作用[[9, 10]。

5. 结 论

本研究应用BMP-7重组腺病毒转染大鼠MSCs，观察其对MSCs骨向分化的促进作用。结果表明，BMP-7可明显加快MSCs骨向分化，且形成矿化结节的数量和体积明显优于对照组；免疫细胞化学和RT-PCR检测进一步证实了BMP-7在MSCs中的有效表达。BMP-7可能通过上述相似机制来发挥对MSCs骨向分化的促进作用。

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Experimental Study on osteogenic differentiation of rat bonemarrow MSCs after transfection with recombinant pAd-BMP7

QI Mengchun1, HU Jing2, ZOU Shujuan2, Dazhang Wang2, LI Jihua2. (1. Dept. of

Stomatology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000; 2. Dept. of Oral & Maxillofac Surg, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Abstract

Objective: To study the effect of recombinant pAd-BMP7 on osteogenic differentiation of rat bone marrow MSCs and dertermine its expression thereafter. Methods: The titer of recombinant adenovirus pAd-BMP7 was first determined. Then, rat bone marrow MSCs were randomly divided into experimental group and control, which were transfected with pAd-BMP7 and pAdTrack-CMV, respectively. The transfection efficiency was determined and osteogenic differentiation of MSCs was observed by examination of mineralization nodes formation under bone supplements. RT-PCR and immunocytochemical analysis were also performed to detect expression of BMP-7 in rat MSCs. Results: The titer of recombinant adenovirus pAd-BMP7 reached about 2.0×1012 pfu/ml and the transfection efficiency of exogenous gene was nearly 100% at day 2. The expression of exogenous gene decreased with the elongation of time, which sustained about 5 to 7 weeks, with a higher level during first 3 weeks. Mineralization nodes formation was faster and greater in experimental group than control. After transfection, transcription of BMP7 was detected in MSCs and expression of BMP-7 protein was also verified. Conclusion: The results of this study indicated that recombinant pAd-BMP7 can successfully expressed in rat MSCs and therefore accelerate their osteogenic differentiation. The gene engineering technique explored in this study may provide a unique and valuable approach for reconstruction of craniofacial bone defects.

Keywords: Bone morphogenetic protein 7; Adenovirus; Gene clone; Mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

作者简介：胡静, 1963-，男，四川人，教授，博士生导师，主要从事正颌与关节的临床及

骨组织工程的研究工作

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