山东医药２０１７年第５７卷第４Ｏ期 成人脂肪干细胞的体外多向分化能力观察 段炼。黄柳明，刘钢，封志纯 （陆军总医院附属八一儿童医院，北京１００７００） 摘要：目的 观察成人脂肪干细胞（ＡＤＳＣｓ）的体外多向分化能力。方法从正常成人脂肪组织分离得到 ＡＤＳＣｓ并体外培养。在ＡＤＳＣｓ中分别加入成人脂肪、骨、软骨、肝细胞的体外诱导培养基诱导，观察诱导过程中细 胞形态的变化，诱导前、诱导１周、诱导２周时采用ＲＴ—ＰＣＲ法观察细胞相应标志物ｍＲＮＡ表达的变化。 结果ＡＤＳＣｓ向脂肪细胞诱导２周，细胞内的脂质空泡聚集，小脂滴融合在一起并变大；最后细胞变为单房，并且充 满脂质，红油Ｏ染色阳性；诱导ｌ周细胞ＰＰＡＲ 、脂蛋白酶和ｃｔＰ２ ｍＲＮＡ表达较诱导前增加；诱导２周细胞ＰＰＡＲ￣／、 脂蛋白酶ｍＲＮＡ表达降低，但仅Ｐ２ ｍＲＮＡ变化不明显。ＡＤＳＣｓ向骨细胞诱导５天，细胞由成纤维形转化为多边形 或不规则状。诱导２周单层细胞聚集成块，形成细胞岛状结构，ＡＬＰ染色阳性，ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色可见黑色矿化结节； 矿化结节形成后细胞向结节移行聚集，促使更多的细胞形成更大的矿化结节；诱导后细胞ＡＬＰ、骨桥蛋白和Ｉ型胶 原ｍＲＮＡ表达逐渐增加。ＡＤＳＣｓ向软骨细胞诱导１周，细胞呈多边形或类圆形，细胞团向内呈放射状聚集，ＦＩＴＣ染 色后免疫荧光可见Ⅱ型胶原；诱导１、２周时细胞Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和ＳＯＸ９ ｍＲＮＡ表达明显高于诱导前。 ＡＤＳＣｓ向肝细胞诱导２周时可见部分细胞变成圆形或椭圆形，并随时间顺延呈肝细胞样圆形细胞增多趋势，细胞 核居中，圆形且边缘清楚，ＰＡＳ染色阳性；诱导１、２周时细胞ＣＫ１８、ＨＮＦｌｏｔ及白蛋白ｍＲＮＡ表达明显高于诱导前。 结论成人脂肪组织中分离得到的成人ＡＤＳＣｓ可在体外定向分化为脂肪细胞、骨细胞、成骨细胞和肝细胞。 关键词：成人脂肪干细胞；体外诱导；多向分化；脂肪细胞；骨细胞；软骨细胞；肝细胞 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１７．４０．０１ １ 一 ● 中图分类号：Ｒ３１８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１７）４０－００３８－０４ 干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能， 是组织工程的基础。目前干细胞主要来源于各种组 单，在人体内储量丰富，更少牵扯伦理、道德、法律方 面的问题，并且同样具有高增殖性和多向分化能力， 在组织工程领域中的作用举足轻重 Ｊ。有研究证 实，脂肪干细胞（ＡＤＳＣｓ）被诱导后能表达成骨细胞、 织，如肌肉、骨髓、脐血或胚胎等。相对于上述来 源的干细胞，脂肪来源的干细胞由于其取材安全、简 脂肪细胞等细胞基因和蛋白标志，即分化为成骨细 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１５００３９１）。 通信作者：封志纯（Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｊｆｅｎｇｚｃ＠１２６．ｅｏｍ） 胞、脂肪细胞等。但目前有关ＡＤＳＣｓ分化能力的研 究仅限于动物嵋 。２０１３年９月一２０１６年９月，本研 ［１Ｏ］Ｚｉｔｔｅｌ ＴＴ，Ｍｅｉｌｅ Ｔ，Ｈｕｇｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｒｌａｕｍｉｎａｌ ａｐｐｌｉ— ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓａｉｅｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇａｓｔｉｃ ｒａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｏｔｉｌ— ［４］Ｍｉｚｕｇｕｅｈｉ Ｓ，ＯｈｎｏＴ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｙ，ｅｔａ１．Ｃａｌｅｉｔｏｎｌｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐ— ｔｉｄｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｍｙｏｅｌｅｅｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ［Ｊ］．Ｊ Ｇａｓｔｅｅｎｔｒｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ，２００５，２０（４）：６１１－６１８． ［５］Ｓｐｅｎｃｅｒ ＮＪ，Ｋｅｒｒｉｎ Ａ，Ｓｉｎｇｅｒ ＣＡ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓａｉ— ｃｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｔａｌ ｍｅｃｈａｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｃｔｌ ｄｉａｓｔｅｎｓｉｏｎ ｉｔｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｇａｓｔｅｒｉｎｔｅｓｔ Ｓｕｒｇ，２００１，５（５）：５０３－５１３． ［１１］胡蓉，史孝敏，唐川康，等．小剂量辣椒素对大鼠内脏化学刺激敏 感性的影响［Ｊ］．中国新药与临床杂志，２０１６，３５（１０）：７４６－７５０． ［１２］Ｓｚｏｌｃｓｄｎｙｉ Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅｒｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａＩ１ ｕｐｄａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，１５３（２）：５１８－５３４． 【６］Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ Ｓ．Ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃｌａｅｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ—ｒｅｌａｔ— ｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｔ￣Ｊ］．Ｐｒｏｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ，２０１４（６８）：２５９－２７６． ［７］Ｓｈｉｂａｔａ Ｃ，Ｓａｓａｋｉ Ｉ，Ｎａｉｔｏ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｒａｇａｓｔｉｆｃ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｓｔｉｍｕ— ｌａｔｅｓ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｐｐｅｒ ｇｕｔ ａｎｄ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｃｏｌｏｎ ｖｉａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ａｕｓｔｉｎ），２０１５，２（２）：２７７－２９６． ［１３］Ｇｅｎｇ ＲＨ，Ｇａｏ Ｊ，Ｌｉ Ｚ．ＴＲＰ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇａｓｒｏｉｎｔｅｓ— ｔｉｎａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１０，１５（３）：１７２．１７４． ［１４］Ａｋｂａｒ Ａ，Ｙｉａｎｇｏｕ Ｙ，Ｆａｃｅｒ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅａｐｓａｉｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲＰＶ１一ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｅｎｓｏｒｙ ｆｉｂｒｅｓ ｉｎ ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｄｏｇｓ［Ｊ］．Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｅｉ，１９９９，４４（６）：１０８３—１０８９． ［８］Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ＲＡ，Ｄｅ Ｂｅｕｒｍｅ ＦＡ，Ｓａｓ Ｓ．Ｒｅｌａｘａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｕｎｄｕｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，１９９１，１９５（１）： １３１．１３７． ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｈ ａｂｄｏｍｉｔｎａｌ ｐａｉｎ［Ｊ］．Ｇｕｔ，２Ｏ０８，５７（７）：９２３－９２９． ［１５］Ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ ＢＹ，Ｂｒｅｄｅｎｏｏｒｄ ＡＪ，Ｖａｎ Ｎａｓｓａｕｗ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅ— ｍｅｎｔ ｏｆ ａｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ［９］Ｈｏｌｚｅｒ－Ｐｅｔｓｃｈｅ Ｕ，Ｓｅｉｔｚ Ｈ，Ｌｅｍｂｅｅｋ Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｐｓａｉｃｉｎ ｏｎ ｇａｓ． ｔｒｉｃ ｃｏｒｐｕｓ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆｔｈｅ ｒａｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ， １９８９，１６２（１）：２９—３６． ｉｌｅｕｓ ｉｎｍｉｃｅ：ｒｏｌｅ ｏｆＣＧＲＰａｎｄＴＲＰＶ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ『Ｊ］．Ｅｕｒ ＪＰｈａｒ． ｍａｃｏｌ，２００９，６１５（１－３）：１７７—１８４． （收稿１３期：２０１６－０９－０４） ３８ 山东医药２０１７年第５７卷第４０期 究观察了成人ＡＤＳＣｓ的体外多向分化能力 现报 告如下。 １材料与方法 分别于诱导前和诱导１、２周采用ＲＴ．ＰＣＲ法检测过 氧化酶增殖激活受体＾ｙ（ＰＰＡＲ ）、脂蛋白酶和脂肪 １．１材料新鲜的正常人体腹部脂肪组织５ ｅｍ× 酸结合蛋白４（ Ｐ２）ｍＲＮＡｏ操作按试剂盒说明书 进行。以ＧＡＰＤＨ为内参照，ＰＣＲ引物电泳拍照观 察各标志物ｍＲＮＡ表达。 １．４ ＡＤＳＣｓ向骨细胞的诱导分化及鉴定诱导方 法同１．３，诱导过程中加成骨的体外诱导培养基。 ５ ｅｍ ｘ５ ｅｍ，取自一名年龄３５岁的男性抽脂患者，患 者已签署知情同意书。成脂肪的体外诱导培养基（含 １０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基，１￣ｍｏｌ／Ｌ地塞米松， １０ ｔｊ．ｒｎｏｌ／Ｌ胰岛素，２００￣ｍｏ］／Ｌ消炎痛，０．５￣ｍｏｌ／Ｌ 每日取所得细胞制作爬片，室温下４％多聚甲醛固 ３一异丁基．甲基黄嘌呤，１％抗生素以及谷氨酰胺）。 成骨的体外诱导培养基（含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养 基，０．１￣ｍｏｌ／Ｌ地塞米松，１０￣ｍｏｌ／Ｌ Ｂ一磷酸甘油钠， ５０￣ｍｏｌ／Ｌ维生素Ｃ，０．Ｏ１ ｌ￣ｏｌ／Ｌ １，２５－二羟维生素 Ｄ ，１％抗生素）。成软骨的体外诱导培养基（含１０％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基，１０ ｎｇ／ｍＬ转化生长因子ｐ】， １００￣ｍｏｌ／Ｌ地塞米松，６．２５ ｍＬ胰岛素， ５０￣ｍｏｌ／Ｌ维生素ｃ，１１０ ｍＬ丙酮酸钠，１％抗生 素）。成肝细胞的体外诱导培养基（含１０％ＦＢＳ的 ＤＭＥＭ培养基，２０ ｒｉｇ／ｍＬ肝细胞生长因子，１０ ｎｇ／ｍＬ 基本成纤维细胞生长因子，４．９￣ｍｏｌ／Ｌ尼克酰胺， ２０ ｎｇ／ｍＬ￣ｌ瘤素Ｍ，１００ ｉ￣ｏｌ／Ｌ胰岛素，６．２５ ｇ／ｍＬ 转铁蛋白，３．６ ＩＪ，ｒｎｏ］／Ｌ亚硒酸，１９０￣ｍｏ］／Ｌ亚油酸， １％抗生素）。鼠抗人ＣＤ２９、ＣＤ４４和ＨＬＡ—ＤＲ单克隆 抗体购自美国ＢＤ公司。ＲＴ－ＰＣＲ逆转录试剂盒购自 上海生工生物工程有限公司，实验所需引物由上海生 工生物工程公司设计合成。 １．２成人ＡＤＳＣｓ分离及鉴定将人脂肪组织剪碎 移人０．０７５％胶原酶Ⅱ溶液中，３７℃水浴３０ ｒａｉｎ。 将所得细胞悬液用细胞滤网过滤后以１ Ｘ １０ ／ｍＬ 接种于６孔培养板，３７ ｏＣ、５％ＣＯ 、９５％湿度条件下 培养。每７２ ｈ换液（１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液） １次。贴壁细胞融合达９０％后，０．２５％胰蛋白酶消 化传代，按１×１０ ／ｍＬ接种于６孔培养板，７２ ｈ换 液１次。第３代细胞加入荧光标记的鼠抗人单克隆 抗体ＣＤ２９、ＣＤ４４和ＨＬＡ—ＤＲ孵育３０ ｒａｉｎ后，使用 流式细胞仪检测，结果显示ＣＤ２９和ＣＤ４４表达均为 阳性，而ＨＬＡ—ＤＲ不表达，证实为脂肪干细胞 Ｊ。 １．３ ＡＤＳＣｓ向脂肪细胞的诱导分化及鉴定 取生 长状态良好的第３代ＡＤＳＣｓ细胞，消化制备成单细 胞悬液，调整细胞密度为１ Ｘ １０ ／ｍＬ，接种于６孔培 养板中，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液２４ ｈ，加 入成脂肪的体外诱导培养基，每３天更换诱导培养 基１次。每日取所得细胞制作爬片，室温下４％多 聚甲醛固定１５ ｒａｉｎ，６０％异丙醇＋１％红油０密闭 染色１０ ａｒｉｎ，６０％异丙醇分色，７Ｏ％乙醇洗去多余染 色剂，再用蒸馏水洗涤数次，光镜下观察细胞形态。 定１５ ｒａｉｎ，缓冲液冲洗后行ＡＬＰ染色和ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ 染色，光镜下观察。分别于诱导前和诱导１、２周采 用ＲＴ．ＰＣＲ法检测碱性磷酸酶（ＡＬＰ）、骨桥蛋白和 Ｉ型胶原ｍＲＮＡ。操作按试剂盒说明书进行。以 ＧＡＰＤＨ为内参照。ＰＣＲ引物在１．５％琼脂糖凝胶 上行电泳。拍照观察各标志物ｍＲＮＡ表达情况的 变化。 １．５ ＡＤＳＣｓ向软骨细胞的诱导分化及鉴定诱导 方法同１．３，诱导过程中加成软骨的体外诱导培养 基。每日取所得细胞，４％多聚甲醛固定，ＰＢＳ反复 冲洗后使用鼠抗人Ⅱ型胶原染色，４ ｏＣ过夜，ＰＢＳ冲 洗３次，使用羊抗鼠ＩｇＧ—ＦＩＴＣ染色１ ｈ，ＰＢＳ反复冲 洗后使用免疫荧光显微镜观察。分别于诱导前和诱 导１、２周采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白 聚糖和ＳＯＸ９ ｍＲＮＡ。操作按试剂盒说明书进行。 以ＧＡＰＤＨ为内参照。ＰＣＲ引物在１．５％琼脂糖凝 胶上行电泳。拍照观察各标志物ｍＲＮＡ表达。 １．６ ＡＤＳＣｓ向肝细胞的诱导分化及鉴定 诱导方 法同１．３，诱导过程中加成软骨的体外诱导培养基。 每日取所得细胞制作爬片，室温下４％多聚甲醛固 定１５ ｒａｉｎ，用过碘酸行ＰＡＳ染色，光镜下观察。分 别于诱导前和诱导１、２周采用ＲＴ．ＰＣＲ法检测 ＣＫ１８、肝细胞核因子ｌ （ＨＮＦ１ ）、白蛋白ｍＲＮＡ。 以ＧＡＰＤＨ为内参照。ＰＣＲ引物在１．５％琼脂糖凝 胶上行电泳。拍照观察各标志物ｍＲＮＡ表达。 ２结果 ２．１ ＡＤＳＣｓ向脂肪细胞的诱导分化结果 诱导 ２４ ｈ后可见细胞变圆，体积增大，胞内有少量脂滴形 成，脂质空泡小并且大多位于细胞核旁。随着诱导 时间的延长，脂滴的数量和体积增加，ＡＤＳＣｓ逐渐 变为多房的脂肪细胞。诱导２周，细胞内的脂质空 泡聚集，小脂滴融合在一起并变大；最后细胞变为单 房，并且与成熟的脂肪细胞一样充满脂质。红油０ 染色阳性。诱导前、诱导１周、诱导２周细胞 ＰＰＡ 、脂蛋白酶和０【Ｐ２ ｍＲＮＡ表达情况见图１。 诱导１周细胞ＰＰＡＲ 、脂蛋白酶和 Ｐ２ ｍＲＮＡ表达 较诱导前增加；诱导２周细胞ＰＰＡＲ￣、脂蛋白酶 ３９ 虹 医 【】ｌ７笙笙三Ｚ鲞箜 ｍＲＮＡ表达降低，但ｄＰ２ ｍＲＮＡ变化不明 。见 罔１ Ａ 周细胞呈多边形或类网彤，细胞 向内呈放射状聚 集。ＦＩＴＣ染色后免疫荧光可 Ⅱ 胶原诱导ｌ、２ ２．２ ＡＤＳＣｓ向骨细胞的诱导分化结果 诱导５天 细胞由成纤维形转化为多边肜或不规则状。２周后 单层细胞聚集成块，形成细胞岛状结构。ＡＩ Ｐ染色 阳性，ＶＯｎ Ｋｏｓｓａ染色可见黑色矿化结节。矿化结节 形成后，细胞向结节移行聚集．促使更多的细胞形成 更大的矿化结节。诱导后细胞ＡＬＰ、骨桥蛋白和Ｊ 周细胞Ⅱ型胶原、聚集蛋ｈ聚糖币ＩＩ ＳＯＸ９ ｍＲＮＡ表 达明 高于诱导前、见罔ｌＣ。 ２．４ ＡＤＳＣｓ向肝细胞的诱导分化结果 诱导２周 ｌ『见部分细胞变成圆形或椭网形，并随时问顺延呈 肝细胞样网形细胞增多趋势．．细胞核居巾， 形且 边缘清楚 ＰＡＳ染色阳性 诱导ｌ、２周细胞ＣＫ１８、 型胶原ｍＲＮＡ表达逐渐增加 见图ｌＢ。 ２．３ ＡＤＳＣｓ向软骨细胞的诱导分化结果 诱导１ 诱导前 诱导１Ｐｄ 诱导２周 ＰＰＡＲ ＨＮＦＩ ｏ【及白蛋白ｍＲＮＡ表达明 高于诱导前 图ｌ Ｄ 诱导前 诱导１周 诱导２周 ＡＬｐ 胰蛋白酶 骨桥蛋白 ｄＰ２ Ｉ型胶原 ＩＩ型胶原 聚集蛋白聚糖 白蛋白 注：Ａ 胙｝盼卸ｊ胞；Ｒ为 Ｈ Ｊ抱；（：ｌ＾Ｊ软 ＨＩ胞；Ｄ为 细胞 图１ ＡＤＳＣｓ向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞诱导前后相应标志物ｍＲＮＡ表达情况 ３讨论 组织工程的目的存于修复受损的组织器官功 能。保持充足的细胞供给和ｆ丁Ｉ变的细胞采集来源． 是细胞治疗的基础 目 髓来源的问允质干细胞是成 滤网去除消化后残余的血管、红细胞以及胶原纤维等 杂质，大大减少了培养基中红细胞和成纤维细胞的数 量；同时选用０．０７５％ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅡ３７ ｏＣ水浴３０ ｍｉｎ， 节约了所用酶 和酶解时ｆｎ】。体外培养ＡＤＳＣｓ的条 体ｆ细胞生物学领域最重要的细胞来源，但其在分 离培养过程中存在着诸多缺陷 ．．脂肪组织由胚 件也较简单，在加有任何批号ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基 巾均能很好地扩增；ＡＤＳＣｓ平均倍增时问为６０ Ｉ ，并 胎问充质生成，相对于由造ｍ细胞和问充质干细胞 混合组成的骨髓干细胞而言，脂肪组织分离的干细 胞具有更大的细胞同质性，在诱导过程中更能保证 分化细胞的一致性，减少了细胞致畸、致瘤等可能；脂肪组织来源充足，获取更容易，累及脂肪组织的疾 能稳定传代ｌ０—１５代 、表明ＡＤＳＣｓ体外细胞培养条 件下呈高增殖率。ＡＤＳＣｓ表达ＣＤ２９和ＣＩＭ４，显示其 具有间充质干细胞的特性 ；而其ＭＨＣ ＩＩ相关蛋白 ＨＬＡ—ＤＲ不表达，说明它们极少表达与移植排斥相关 的抗原分子，提示ＡＤＳＣｓ具有免疫逃逸特性，可能进 病发病率很低 。因此，ＡＤＳＣｓ应是一种比骨髓来 源的间充质十细胞更理想的组织工程种子来源 。 行同种异体移植。 ＡＤＳＣｓ在成脂肪诱导过程中， 微镜下可观察 研究发现，ＡＤＳＣｓ的分离效率高于其他十细胞。 有文献选刚ＮＨ ＣＩ裂解红细胞 ，这样可能会影响 分离得到的干细胞质 。本研究我们选择使用细胞 ４０ 到细胞内脂滴聚集、融合并变大，能特异性将脂滴染 成红色的油红０染色呈强阳性 ；同时向脂肪细胞 诱导后的细胞表达ＰＰＡＲｙ、脂蛋白酶、仅Ｉ）２ ｍＲＮＡ， 山东医药２０１７年第５７卷第４０期 说明诱导后细胞已具有脂肪细胞特性。 成骨细胞的基本标志是能分泌ＡＬＰ和钙 ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｉｒｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｌｉｆｅ Ｓｅｉ，２０１４，２４（１１）：１２３８—１２４３． 盐 。本研究结果显示，成骨诱导１—２周，可以观 ［５］Ｔａｋｅｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｚｈａｏ Ｄ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ 察到矿化结节，细胞ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色呈阳性，证实分 化细胞分泌钙盐并有钙沉积；ＡＬＰ染色阳性说明经 成骨诱导后的ＡＤＳＣｓ已具有成骨细胞特征。 ＲＴ—ＰＣＲ结果显示，向骨细胞诱导后的细胞ＡＩＪＰ、骨 桥蛋白和Ｉ型胶原ｍＲＮＡ表达增加。骨桥蛋白是成 骨作用的重要信号¨ ，在诱导过程中的长时间表达 可以证实成骨作用发生，诱导后的细胞已有骨细胞 特性。 软骨的网状支架结构主要由Ⅱ型胶原构成，聚 集蛋白聚糖在软骨中起抗压以及维持软骨弹性的作 用，Ｓｏｘ９则在软骨生成中促进间充质细胞凝 集 。本研究结果显示，向软骨诱导后的细胞分 泌Ⅱ型胶原，ＲＴ—ＰＣＲ结果显示，诱导后细胞Ⅱ型胶 原纤维、聚集蛋白聚糖和ＳＯＸ９ ｍＲＮＡ表达增加，证 实诱导后的细胞具有软骨细胞特征。 本研究ＰＡＳ染色结果证实，向肝细胞诱导的细 胞糖原贮积，ＲＴ．ＰＣＲ结果显示ＡＤＳＣｓ向肝细胞诱 导２周后，ＣＫ１８、ＨＮＦ１ｏＬ和白蛋白ｍＲＮＡ表达增 加，说明诱导后的细胞已具有肝细胞功能。 综上所述，成人脂肪组织能够分离培养出 ＡＤＳＣｓ，其在体外具有多向分化的潜能，并且不具有 免疫原性 。基于上述理由，我们认为ＡＤＳＣｓ可 以成为干细胞的新来源，其在组织工程的临床应用 方面具有重要作用。 参考文献： ［１］Ｈａｎ ＳＦ，Ｗａｎｇ Ｂ，ＬｉＸ，ｅｔ ａ１．ＢｏｎｅｍａｌＴｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ・－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａ－ ｔｉｏｎ ｂｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉ－ ｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，２０１６，１０４（７）：１７５９． ［２］Ｌｉ Ｌ，Ｊａｉｓｗａｌ ＰＫ，Ｍａｋｈｏｕｌ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｐｏｘｉａ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｍｉ－ ｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ ３．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，２０１７，１５４（２）：５４３－５５２． ［３］段炼，宋智钢，徐志云，等．成人脂肪干细胞的生物学特性［Ｊ］． 解剖学杂志，２００９，３２（４）：４４８－４５０． 『４］Ｋｉｍ ＳＨ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａ．ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａＦｌ＇ｏｗ ａｎｄ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｎｉｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｖｅｔ Ｒｅｓ，２０１２（８）：１５０． ［６］Ｐａｒｋ ＹＨ，Ｊｕｎｇ ＫＪ，Ｓｏｎｇ ＩＨ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ— ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１４，２９（１２）：２４３０－２４３０． ［７］Ｓａｒｈａｎ Ｍ，Ｅ１ ＳＨ，Ｈｕｓｓｅｉｎ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆｂｏｎｅ－ｍａｌＴＯＷ．ｄｅ— ｉｒｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－・ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅ－ ｐｈｒｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４，９２（９）：７３３． ［８］Ｐｅｒｏｎｉ Ｄ，Ｓｃａｍｂｉ Ｉ，Ｐａｓｉｎｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｅｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２００８，３１４（３）： ６０３＿６１５． ［９］Ｇｈａｓｅｍｉ Ａ，Ｍａｍｄｏｕｈ Ｆ，Ｇｈｏｌａｍｉ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｖｌａｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａ— ｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｌＴｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌｎａｔ ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔ，２０１４，２（２－３）：７４０￣４４． ［１０］Ｄａｒｌｉｎｇ ＥＭ，Ｔｏｐｅｌ Ｍ，Ｚａｎｓｃｈｅｒ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄｐｒｉｍａｒｙ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ， ｅｈｏｎｄｍｃｙｔｅｓ，ａｎｄ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｍｅｃｈ，２００８，４１（２）：４５４— ４６４． ［１１］Ａｎａｎ ＨＨ，Ｚｉｄａｎ ＲＡ，Ｓｈａｈｅｅｎ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｉｆｃａｃｙ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｍｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ ｌｏｓａｒｔａｎ ｏｎ ａｄｒｉａｒｎｙｅｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｃｏｎｉｃａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｌｂｉｎｏ ｒａｔｓ［Ｊ］． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，１８（８）：９７０． ［１２］Ｅｍｂａｂｙ ＡＳ，Ｍｅｔｗａｌｌｙ ＨＧ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍａｌｅ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｅｇｙ Ｊ Ｈｉｓｔｏｌ，２０１５，３８（４）： ７２１＿７３１． ［１３］Ｃｈｕｎｇ ＣＳ，Ｆｕｊｉｔａ Ｎ，Ｋａｗａｈａｒａ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏ— ｓｐｈｅｒｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｌＴＯＷ－・ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｕｅｓ・－ ｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔｅｒｉｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２０１３，７５（７）：８７９． ［１４］Ｚｏｊａ Ｃ，Ｇａｒｃｉａ ＰＢ，Ｒｏｔａ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｎａｌ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｇｌｏｍｅｒｕｌｒａ ｐｏｄｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉ－ ｔｏｒ ｃｅｌｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１２，３０３（９）：１３７０． ［１５］Ｖｉｓｈｎｕｂａｌａｊｉ Ｒ，Ａ１一Ｎｂａｈｅｅｎ Ｍ，Ｋａｄａｌｍａｎｉ Ｂ，ｅｔ １ａ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｏｎｅ－・ｍａｌＴｏｗ－・ａｎｄ ａｄｉｐｏｓｅ－－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉ－－ ｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２０１２，３４７（２）：４１９－４２７． （收稿１３期：２０１６—１０—１０） ４１