培养基验收作业指导书删减版

培养基质量控制作业指导书

1、目的：

为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书； 2、范围：

本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。

3、职责：

3.1 检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。

3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。 4、控制措施：

4．1培养基的购置和验收

4.1.1 培养基的购置

试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的pH值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危害数据）。 4.1.2 培养基的验收

购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。 4．2培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或6个月内用完。应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽

变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。即用性培养基

按照产品标识要求进行储存。 4．3培养基的使用

4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿

培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的

玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥

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4.3.2 称量

称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。 4.3.3 复水

复水时应注意以下事项：

a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；

b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；

c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；

d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热； e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；

f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；

g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。 4.3.4 灭菌

培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。

为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。

4.3.5 pH测定

在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25℃温度下采用精密PH 试纸测试PH值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。 4.3.6 配制好的培养基标识和保存

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时填写配制记录。内容：名称、配制量、配方（比）、操作中

的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。

培养基保存注意事项：

1）环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以2-8℃左右为宜，不得冻结。

2）保存时限: 基础培养基应在30天内用完。鉴别培养基应在21天内用完。选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜(袋)密闭保存期限可延长至一周。从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.

4．4培养基批号的的管理

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培养基的批号由6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取2位，年份取后2位，月和日不足2位时，分别在数字前加0，表明是本日配制的批号。如2004年6月4日配制的培养基，批号为040604。 4.5质量检查

购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经30～35℃培养48小时，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。。成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告

4.5 培养基的性能测试

新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，

根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告，菌株的选择参考SN/T

1538.2-2007《培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南》。 4．5．1物理指标控制

1） 测试20℃～25℃的pH值

2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质； 4．5．2微生物污染的控制

从每批制备好的培养基中选取至少一个（或1%）平板或试管，置于35-37℃或按特定标准中规定的温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长。 4．5．3微生物学指标控制

可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：

（1）生长率

将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。

1）定量方法

生长率PR的计算： PR = NS/NO

NS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。

N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100cfu ）。

要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU～100CFU。

2） 半定量方法

半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数G，G值不应超过标准规定的允许范围。

3） 定性方法

定性方法采用划线法观察。 ①选择性

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将浓度为10CFU/mL～10CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。

②定量方法

选择因子SF： SF = DO - DS

DO：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度 DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度

要求：非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2 ；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。 ③生理生化特性（选择性和特异性）

规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。

（2）性能评价和结果解释

按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。

表1 计数用选择性培养基

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培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 控制养基 方法参考培控制 养基TSA —— TSA —— —— TSA TSA —— —— —— —— TSA —— 判定标准 特征反应 用途 培养条件测试菌株 37℃ 金黄色葡萄球菌生长率 24-48h ATCC6538/25923 大肠杆菌Baird- VRBG（结晶大肠杆菌ATCC25922/8739 Parker 选择性 37℃48h 紫中性红生长率 37℃24h ATCC25922/8739 鼠伤寒沙门菌[S] 胆盐葡萄37℃表皮葡萄球菌ATCC14028 特异性 糖琼脂） 24-48h ATCC12228 粪链球菌[S] 选择性 37℃20h 30℃腊样芽胞杆菌ATCC29212/19433 生长率 24-48h ATCC11778 大肠杆菌生长率 30℃20h MYP 大肠杆菌ATCC25922/8739 选择性 37℃48h VRBL（紫红[S] ATCC25922 粪链球菌胆汁乳糖） 选择性 30℃20h 枯草芽胞杆菌特异性 37℃48h ATCC29212/19433 [S] ATCC6633 铜绿假单胞菌特异性 30℃20h ATCC27853 CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂） [S] 特异性 37℃24h 选择性 37℃24h 生长率 37℃24h 大肠杆菌O157：H7 ATCC43894/43895 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 大肠杆菌ATCC11775/25922 大肠杆菌BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤） [L] 选择性 44℃24～48h 44℃24～48h 44℃24～48h 44℃24～48h 生长率 ATCC25922/8739 30℃24-48h 弗氏柠檬酸杆菌 ATCC25922/8739 粪链球菌ATCC29212/19433 大肠杆菌ATCC25922 铜绿假单胞菌ATCC27853 大肠杆菌ATCC25922 铜绿假单胞菌ATCC27853 大肠杆菌ATCC25922 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 大肠杆菌ATCC25922 福氏志贺氏菌CMCC51572 bb判定标准 黑色/灰色菌落，周围为特征反应 方法 定量 PR≥0.5 一混浊带，其外有透明带 定性 带有或不带沉淀带的粉—— 定量 全部抑制PR≥0.5 定性 一混浊带，其外无透明带 定性 全部抑制 —— 定量 PR≥0.7 具沉淀带的粉色菌落 带有或不带沉淀带的淡—— 红色或红色菌落 黑色/灰色菌落，周围为定量 PR≥0.5 定性 全部抑制 紫色菌落 —— 定性 全部抑制 —— 定性 —— 不具沉淀带的粉色菌落 定性 -- 无色至浅棕色菌落 透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm 定量 PR≥0.5 定性 全部抑制 —— 定性 —— 浊度2+，导管1/3产气并浑浊 产气 粉色菌落 半定TSA 量 定性 不生长 —— 半定量 浊度2+，导气管1/3产气并浑浊 产气 EC [L] 生长率 —— 选择性 —— 定性 不生长 —— 半定量 浊度2+，导气管1/3产气并浑浊，产生荧光 产气 EC-MUG/ 生长率 LS-MUG [L] 选择性 —— —— —— —— —— —— 定性 不生长 —— 半定导气管1/3量 定性 产气 —— 产气并变黄色 乳糖胆盐发酵培养 [L] 生长率 37℃24h 选择性 37℃24h 不产气、仍为紫色 LST（月桂生长率 37℃24h 酸肉汤） .

半定导气管1/3量 定性 产气 —— —— [L] 选择性 37℃24h —— .

表2 计数用非选择性培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 大肠杆菌PCA（平板计数琼脂） [S] 生长率 30℃72h ATCC25922/8739 金黄色葡萄球菌ATCC6538 枯草芽孢杆菌ATCC6633 表3 选择性增菌培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 大肠杆菌EE [L] 选择性 生长率 37℃24h ATCC25922/8739 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 粪肠球菌ATCC29212 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 生长率 RVS [L] 41.5℃24h 41.5℃24h 肠炎沙门氏菌ATCC13076 铜绿假单胞菌ATCC27853 大肠杆菌选择性 ATCC25922 粪链球菌 ATCC29212 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 SC(亚硒酸盐胱氨酸) [L] 选择性 37℃24h 生长率 37℃24h +大肠杆菌ATCC25922 +铜绿假单胞菌ATCC27853 大肠杆菌ATCC25922 粪链球菌 ATCC29212 TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液) [L] .

b参考培 控制养基 方法 判定标准 特征反应 TSA 定量 PR≥0.7 —— 控制方法 判定标准 特征反应 VRBG上＞半定量 10CFU 粉红至红色菌落，有或没有沉淀带 全部抑制 XLD或其他选半定量 择性培养基上＞10CFU —— TSA上全抑制 半定量 TSA上＜10CFU —— XLD或其他选半定量 择性培养基上＞10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准） 半定量 TSA上＜10CFU —— 鼠伤寒沙门菌生长率 37℃24h ATCC14028 伤寒沙门菌CMCC50071 选择性 37℃24h 大肠杆菌半定量 XLD或其他选择性培养基上＞10CFU TSA上＜不同培养基上菌落特征不同（见标准） —— . ATCC25922 霍乱弧菌生长率 碱性蛋白胨水 [L] 选择性 37℃24h 37℃24h CMCC16109 副溶血性弧菌CMCC20001 大肠杆菌ATCC25922/8739 福氏志贺氏菌CMCC51572 7.5%氯化钠肉汤[L] 生长率 37℃24h 金黄色葡萄球菌ATCC6538

表4 非选择性增菌培养基 培养基 BHI 蛋白胨盐 [L] 稀释 用途 培养条件 测试菌株 金黄色葡萄球菌ATCC6538 大肠杆菌20～25℃45min ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC25923 定量 控制方法 定性 半定量 10CFU TCBS或其他选择性培养基上＞10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准） TSA上＜10CFU B-P平板或其半定量 他培养基上＞10CFU —— 不同培养基上菌落特征不同（见标准） 判定标准 浊度1～2 +/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数 特征反应 —— 生长率 37℃24h ——

表4 非选择性增菌培养基（续） 培养基 乳糖蛋白胨肉汤 [L] SCDLP液体培养基 [L] 液体沙氏培养基[L] 真菌培养基[L] 生长率 26℃5天 生长率 26℃5天 生长率 37℃24h 用途 培养条件 测试菌株 大肠杆菌ATCC25922 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 铜绿假单胞菌ATCC27853 大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538 白色念珠菌CMCC98001 白色念珠菌CMCC98001

表5 选择性分离培养基 培养基 .

控制方法 —— —— 判定标准 定性 定性 特征反应 导气管1/3产气 —— 生长率 37℃24h 选择性 37℃24h 定性 浊度1～2 —— 定性 浊度1～2 —— 定性 浊度1～2 —— 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 . 鼠伤寒沙门菌亚硫酸酸铋琼脂（BS） [S] 选择性 生长率 37℃48h ATCC14028 福氏志贺氏菌CMCC51572 大肠杆菌ATCC25922/8739 粪链球菌ATCC29212/19433 鼠伤寒沙门菌生长率 XLD [S] 选择性 37℃24h ATCC14028 福氏志贺氏菌CMCC51573 大肠杆菌ATCC25922/8739 粪链球菌ATCC29212/19433 血琼脂平板 [S] 生长率 金黄色葡萄球菌37℃24～48h ATCC6538/25923 粪链球菌ATCC29212 霍乱弧菌TCBS [S] 生长率 37℃24～48h CMCC16109 副溶血性弧菌CMCC20001 霍乱弧菌4号琼脂 [S] 选择性 37℃24h

表5 选择性分离培养基（续） 培养基 用途 培养条件 测试菌株 大肠杆菌伊红美兰琼脂 [S] 生长率 37℃24h ATCC25922/8739 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 福氏志贺氏菌CMCC51573 TSI(三糖铁琼脂) 生长率 [S] 大肠杆菌37℃24-48h ATCC25922/8739 普通变形杆菌 CMCC49001 控制方法 判定标准 定性 定性 定性 定性 定性 生长率 37℃24～48h CMCC16109 非O1群霍乱弧菌CMCC17045 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 定性 定性 定性 定性 定性 定性 定性 良好生长(2) 定性 良好生长(2) 菌落呈黑色，有金属光泽 菌落呈棕色 无典型菌落 抑制（0～1） 全部抑制（0） -- 菌落呈黑色 菌落呈无色 无典型菌落 抑制（0～1） 全部抑制（0） -- 良好生长 β溶血，透明溶血环 良好生长 α溶血,草绿色溶血环 全部或部分全部或部分良好生长 菌落较大，呈黄色 良好生长 菌落较大，呈绿色 良好生长 良好生长 全部或部分菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 —— 抑制（0～1） 特征反应 良好生长 菌落紫黑色带金属光泽 良好生长 菌落灰白色半透明 良好生长 菌落灰白色半透明 良好生长 良好生长 斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性 斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性 .

. 福氏志贺氏菌CMCC51573 鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性 定性 良好生长 良好生长 底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性 底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性 表6 非选择性分离培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 大肠杆菌营养琼脂 [S] 生长率 37℃24h ATCC25922 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 小肠耶尔森氏菌ATCC23715 c控制方法 判定标准 特征反应 定性 良好生长(2) --

8.管理

8.1.贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。

8.2.使用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，

如发现失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用 8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去。 9、记录

商品化培养基/成品培养基目录清单 培养基试剂入库登记表 培养基配制记录

培养基质量控制性能测试记录及评估报告 培养基标签

培养基制备用水检测记录 10引用标准

10.1 GB/T27405-2008.实验室质量控制规范 食品微生物检测[S].

10.2 SN/T1538.1-2005.培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则[S]. 10.3 SN/T1538.2-2007.培养基制备指南 第2部分：培养基性能测实用指南[S].

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