对冠腐病感染期禾谷类组织中镰刀菌属小麦冠腐病菌的一个快速的微分染色技术

姓名：王永刚

编号：C2

学号：2012301110091

班级：硕士育种二班

导师：孙东发

对处于冠腐病感染期禾谷类组织中镰刀菌属小麦冠腐病菌的一个快速的微分染色技术

N. L. Knight and M. W. Sutherland

Centre for Systems Biology, Faculty of Sciences, University of Southern Queensland, Toowoomba, Qld 4350, Australia

A novel fluorescence-based differential staining procedure has been developed for the rapid visualization of Fusarium pseudograminearum hyphae in cereal tissues. Infected tissues are stained with safranin, which binds to host cell walls, while hyphal tissues are stained with the fluorescent dye solophenyl flavine 7GFE. The method is rapid, does not require clearing of culm cross-sections, and

provides high contrast informative images of fungal and plant structures during pathogenesis.

Keywords: cereals, fluorescent microscopy, Fusarium pseudograminearum, staining,visualization

为了禾谷类组织中镰刀菌属小麦冠腐病菌菌丝的快速可视化，一种新型的基于荧光鉴别的染色方法已经被开发。受感染的组织被番红染料所附着，它结合到宿主的细胞壁，而菌丝组织被荧光染料—直接荧光嫩黄7GFE所染色。该方法具有快速，不需要清除茎秆横截面，并提供高对比度的真菌和植物结构在发病期的信息图像。

关键词：谷物 荧光显微镜 镰刀菌 小麦冠腐病 染色 可视化

引言：

在植物的发病机制研究中，在显微镜下观察宿主组织中真菌结构生长的能力是一个重要的工具。多年来，报到了许多突出植物组织中真菌结构的染色技术(Johansen,1940; Meyberg,1988; Saha等人.,1988)。特别是，一些技术、像荧光显微镜技术，增强了我们观察植物组织中菌丝的能力(Duckett &Read,1991;Hood & Shew,1996;Schafer等人., 2004)。新近的绿色荧光蛋白已经被用于真菌的转化(Lorang等人.,2001; Oren等人l., 2003)，特别是标记真菌结构以易于观察。然而，虽然这种方法在已转化的生物体和宿主之间产生了一种良好的对比，但是它需要相当长的时间才能产生一个可行的绿光荧光突变体，并且严重限制了可被检测的真菌菌株的数量。因此，快速的常规染色方法能够在宿主和病原体之间产生类似的高对比度而不需要遗传转化，这是非常可取的，并且，它们容许观测一个真菌病原体的多种基因型而不需要遏制与转基因生物体相关的约束条件。这项研

究利用幼苗和感染了镰刀菌属小麦冠腐病菌的成年寄主，阐明了一种对荧光染色和冬季谷物中真菌感染观测的改进方法以及在大麦和小麦中引起冠腐病的一个主要原因。

材料与方法：

按照Mitter等人(2006)所描述的面包大麦(Triticum aestivum)，硬粒小麦(Triticum turgidum durum)，大麦(Hordeum vulgare) 和燕麦(Avena sativa)的接种幼苗和在接种后的3~35天所收获的叶鞘；从Leslie研究中心、DEEDI、Toowoomba、Queensland和澳大利亚实地收集的被条锈病感染的小麦叶片样本和被白粉病感染的大麦叶片样本；受感染的叶片和叶鞘按照Hu ckelhoven & Kogel (1998)和Schafer 等人.(2004)所描述的方法清理并固定。简而言之，①把组织放置在清洗液中（0.15%的三氯乙酸[w ⁄ v]酒精溶液：氯仿[4:1; v ⁄ v]）48小时，在这段时间之内更换一次溶液；②将样品用50%的酒精溶液清洗两次两次2×15min；③用50mM的NaoH清洗两次2×15min；④用超纯水清洗三次3×10min；⑤随后接着在0.1M Tris ⁄ HCl溶液(pH=8.5)中孵化30min；⑥将样品立即染色或者储存在50%(v ⁄ v)的甘油中；

成年植株是在播种后让接种的幼苗材料在5L的盆中生长直到16周，用切片机的刀片对每个茎杆进行徒手切片。脆弱的组织，像被严重感染的茎杆或者叶鞘，按照Frohlich (1984)描述的那样用手在两片保鲜膜之间剖开。

已经有一系列的基于荧光显微技术的染色方法被应用。最初，荧光染料是根据它们对受感染小麦组织中镰刀菌属小麦冠腐病菌菌丝独特的染色能力而进行评价的。这些染料包括Uvitex

2B(Polysciences公司.;Moldenhauer等人.,2008)；3,3￠

-dihexyloxacarbocyanine 碘化物(Invitrogen公司;Duckett & Read, 1991)；滂胺坚牢猩红4B (Kemira Pigments; Hoch等人.,2005)和直接荧光嫩黄7GFE (Ciba Specialty

Chemicals公司; Hoch等人.,2005)。调查非荧光染料苯胺蓝、甲苯胺蓝色和番红对植物组织特定的染色和相同时间淬火冷却自发荧光的能力，每一个被测的非荧光染料结合每一个荧光染料去评估寄主和病原物之间染色对比的程度。

最初的实验用各四个荧光燃料的其中之一对组织染色5min，每个染料用高纯度的水配置(MilliQ系统,Millipore公司)，除非另有说明。染料溶液是Uvitex 2B(0.% w/v)，3,3￠-dihexyloxacarbocyanine碘化物(ug/ml )的酒精溶液, 滂胺坚牢猩红4B(0.1% v/v)和直接荧光嫩黄7GFE(0.1%w/v )。然后用水冲洗几次，再对组织进行微观测评。

随后的实验是最初用非荧光染料处理的组织，无论是苯胺蓝（0.1% w/v）、甲苯胺蓝（0.05w/v）、还是番红（0.2g番红配100ml10%的酒精）均染色5min，接着用水将组织冲洗数次，再用四个荧光染料的其中之一染色5min，组织经水冲洗几次后进行微观测评。

经过最初的实验确定哪种方法最佳，组织样品在番红溶液中染色5min后用超纯水冲洗三次，接下来将这些组织在直接荧光嫩黄7GFE（ 0.1w/v配0.1M Tris ⁄ HCl[pH=8.5]）染色10min，再用水清洗四次4×10min。

样品固定在50%（v/v）的甘油中,在配置UV-2A过滤器（激发过滤器，330-380nm；分色镜，400nm；屏障过滤器420nm）的荧光显微镜下观察。用微缩5.0RTV数码相机(QImaging)和分析软件(Soft Imaging System)获取照片。

结果：

虽然每一种荧光染料都对菌丝染色，但在寄主和真菌之间并没有获得强烈的对比，这是由于双方的自身荧光和寄主组织的染色所造成的（Fig1.a、b和c)。连续的组织染色，刚

开始用非荧光染料苯胺蓝或者番红对组织染色，接下来再用一种荧光染料对真菌组织进行染色，产生了最详实的视觉图像，在植物组织和真菌组织之间呈现出强烈的对比。所观察到最清晰的图像是组织经过番红和直接荧光嫩黄7GFE染色产生的(Fig.1d)。这种组合染色的方法在此之前没有报到过。

在制片之前对叶鞘组织进行固定和清洗，让组织纵向平坦，以便于观察到组织表面的和内部的菌丝。与此相反的是，取自成年植株上的茎节组织，在经过和没有经过固定和清洗步骤的最初处理，其结果表明，要得到令人满意的染色结果，固定和染色的步骤是不必要的。这便显著减少了茎节组织的准备时间。

直接荧光嫩黄7GFE附着在菌丝体的细胞壁上，使菌丝隔膜产生明显的区分(Fig.1e)，同时与植物细胞壁产生强烈的对比(Fig.1f)。小麦组织的横剖面能够让菌丝体的细胞外和细胞内都能可视化(Fig.1g，h)。番红染色能够充分的萃取植物组织的自身荧光，也允许足够的红的番红使植物细胞壁同菌丝体的绿色或者蓝色荧光区分开来。宿主细胞的荧光是不同的，这与细胞类型和受感染程度有关。可以观察到年幼的植物组织不容易被番红染色，这极有可能是因为年幼的植物组织含有少量的木质素。然而，这已经足够看得见菌丝体了。如Figure 1所示，相比于面包小麦组织，受镰刀菌属小麦冠腐病菌感染的硬粒小麦、大麦和燕麦显示出相同成功的和相似的染色结果。分别受白粉病菌和条锈病菌感染的大麦和小麦的后续染色表明这种染色方法能够从一系列的分类群中可视化真菌的病原物。

讨论：

以前有报道直接荧光嫩黄7GFE可以染色多种真菌的细胞壁，包括酿酒酵母、菌核病菌、十字花科黑斑病菌、根腐病菌、叶点霉菌、禾生刺盘孢菌、炭疽病菌、卵菌纲致病霉疫菌、畸雌腐霉和德巴利腐霉(Hoch等人.,2005；Oliver等人l.,2009；Takahara等人.,2009)。然

而，迄今为止，用这种染料在寄主组织内染色菌丝体的报到是Oliver等人关于腐霉属感染寄主苔藓的研究(2009)。

直接荧光嫩黄7GFE以同荧光增白剂M2R类似的方式染色真菌的细胞壁和隔膜。然而，当暴露在选定波长的光下，直接荧光蛋白7GFE的褪色不是那么的快(Hoch等人.,2005；Anderson 等人.,2010)。Hoch等人（2005）的报道称，相比于含有几丁质细胞壁的真菌种类，细胞壁含有纤维质成分的卵菌通常具有更为强烈的荧光；然而，对观察这两种细胞壁的类型而言，这些荧光已经足够了。Anderson等人(2010)在一项植物细胞壁的研究时描述了直接荧光嫩黄7GFE的特点，这种特点决定了它对含有β-1，4键的多糖具有选择性，含有这种键类型的分子在植物细胞壁和真菌细胞壁都是常见的(Bartnicki-Garcia,1968)，这就解释了为什么单独使用直接荧光嫩黄7GFE染色不易把植物细胞和真菌菌丝体区分开来。通过包括一个附加的染色过程，使用像番红这样的一种染料，它能够选择性的结合在在植物细胞壁中所发现的成分之上，像木质素、木栓质和角质(Ruzin,1999；Lodish等人.,2000)，从而观察到了植物细胞壁和真菌细胞壁的一个明显区别。

这种同时用番红和直接荧光嫩黄7GFE进行连续染色的新颖的方法，在真菌细胞壁和植物细胞壁之间产生了很强的差异，说明了使用一种组合的染料可以增强真菌和植物细胞结构的可视化能力。这种方法除了快速和简单自然以外，还有一个优点就是染色的样本能够保留显著的荧光至少两个月的时间。当前，这种方法正被广泛的运用于在面包小麦，硬粒小麦和大麦中镰刀菌属小麦冠腐病感染的研究。在此研究中，直接荧光嫩黄7GFE染色多种真菌细胞壁，像谷物发病组织中镰刀菌属小麦冠腐病菌、小麦条锈病菌和白粉病菌的能力表明了，用这种方法在显微镜下去检查其他的植物和病原菌关系应该证明是有用的。

Figure 1 (a—d):生长期为28天的面包小麦(Triticum aestivum)叶鞘组织经过清理、固定和染色后的效果。在清理和固定之后，谷物组织的自发荧光降低。在直接荧光嫩黄7GFE染色之后，菌丝体可见但不能与植物组织区分开来。（a）在清理之前的组织荧光.（b）在清洗之后的组织荧光。棕色变色是由真菌感染所引起的病变。（c）对清理和固定的组织仅仅用直接荧光嫩黄7GFE染色。菌丝体可见，但没有与寄主形成强烈对比。（d）清理和固定的组织用番红和直接荧光嫩黄7GFE染色。菌丝体明显和寄主组织区分开来。（e，f）：清理和固定生长期为28天的面包小麦叶鞘组织，用番红和直接荧光嫩黄染色。在经过染色后，菌丝体和隔膜非常明显。植物细胞的自身荧光已经被番红萃灭。（e）受感染的组织菌丝体生长严重。（f）菌丝体生长在表皮细胞内和跨表皮细胞的生长。（g，h）：生长期为16周的植株中，未清理的横截面在面包小麦细胞和菌丝体之间显示出明显不同。（g）镰刀菌属小麦冠腐病菌在小麦节间的导管组织内的生长。（h）镰刀菌属小麦冠腐病菌在节间的非导管组织内的生长。（i）小麦白粉病菌分生孢子在经过清理和固定的开花期大麦叶鞘表面上的生长。（j）小麦条锈病菌菌丝体在经过清理和固定的开花期面包小麦叶鞘中的生长。（k）从经过清理和固定的开花期面包小麦叶片上喷发出的小麦条锈病菌。以上组织均是在UV-2A滤光镜下观察到的。

参考文献：

References

1. Anderson CT, Carroll A, Akhmetova L, Somerville C, 2010. Realtime imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant Physiology 152, 787–96.

2. Bartnicki-Garcia S, 1968. Cell wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy

of fungi. Annual Review of Microbiology 22,87–108.

3. Duckett JG, Read DJ, 1991. The use of the fluorescent dye, 3,3￠-dihexyloxacarbocyanine iodide, for selective staining of ascomycete fungi associated with liverwort rhizoids and ericoidmycorrhizal roots. New Phytologist 118, 259–72.

4. FrohlichMW, 1984. Freehand sectioning with parafilm. Stain Technology 59, 61–2.

5. Hoch HC, Galvani CD, Szarowski DH, Turner JN, 2005. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia 97, 580–8.

6. HoodME, Shew HD, 1996. Applications of KOH-aniline blue fluorescence in the study of plant-fungal interactions.Phytopathology 86, 704–8.

7. Huckelhoven R, Kogel K-H, 1998. Tissue-specific superoxide generation at interaction sites in resistant and susceptible nearisogenic barley lines attacked by the powdery mildew fungus (Erysiphe graminis f. sp. hordei). Molecular Plant-Microbe Interactions 11, 292–300.

8. Johansen DA, 1940. PlantMicrotechnique. NewYork, USA:McGraw-Hill.

9. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J, 2000.

Molecular Cell Biology. NewYork, USA:W. H. Freeman.

10. Lorang JM, Tuori RP,Martinez JP et al., 2001. Green fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology 67, 1987–94.

11. MeybergM, 1988. Selective staining of fungal hyphae in parasitic and symbiotic plant-fungus associations. Histochemistry 88,197–9.

12. Mitter V, ZhangMC, Liu CJ, Ghosh R, GhoshM, Chakraborty S,2006. A high-throughput glasshouse bioassay to detect crown rot resistance in wheat germplasm. Plant Pathology 55, 433–41.

13. Moldenhauer J, Pretorius ZA, Moerschbacher BM, Prins R, Van DerWestuizen AJ, 2008. Histopathology and PR-protein markers provide insight into adult plant resistance to stripe rust of wheat. Molecular Plant Pathology 9, 137–45.

14. Oliver J, Castro A, Gaggero C et al., 2009. Pythium infection activates conserved plant defense responses in mosses. Planta 230, 569–79.

15. Oren L, Ezrati S, Cohen D, Sharon A, 2003. Early events in the Fusarium verticillioides-maize interaction characterized by using a green fluorescent protein-expressing transgenic isolate. Applied and Environmental Microbiology 69, 1695–701.

16. Ruzin SE, 1999. PlantMicrotechnique andMicroscopy. Oxford，UK: Oxford

University Press.

17. Saha DC, Jackson MA, Johnson-Cicalese JM, 1988. A rapid staining method for detection of endophytic fungi in turf and forage grasses.

Phytopathology 78, 237–9.

18. Scha¨fer P, Hu¨ckelhoven R, Kogel K-H, 2004. The white barley mutant Albostrians shows a supersusceptible but symptomless interaction phenotype with the hemibiotrophic fungus Bipolaris sorokiniana. Molecular Plant-Microbe Interactions 17,366–73.

19. Takahara H, Dolf A, Endl E, O’Connell R, 2009. Flow cytometric purification of Colletotrichum higginsianum biotrophic hyphae from Arabidopsis leaves for stage-specific transcriptome analysis.The Plant Journal 59, 672–83.