三种美白剂对B16细胞黑素合成影响的研究
姓名：吴品茹申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：刘健航
20080501
上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 摘 要
熊果苷,甘草黄酮及新型内皮素拮抗剂对小鼠黑素瘤细
胞黑素生成影响的比较研究
摘 要
目的：黑色素对于防止皮肤受到紫外线辐射损伤具有重要作用，但是当皮肤局部黑素生成过多或分布不均，就会出现各种色素沉着性疾病，如黄褐斑，雀斑，脂溢性角化斑以及炎症后色素沉着等，影响美观。部分传统美白药物的机理功效以及对黑素细胞的毒性还不明确，与一些新颖的天然提取美白成分尚缺乏明确的比较和分析。本研究通过比较观察熊果苷，甘草黄酮及新型内皮素拮抗剂对体外培养B16鼠黑素瘤细胞黑素生成的影响，探讨黑素合成机制，评估药物安全性，为新一代美白药物的研发提供理论思路和实践方向。
方法：实验使用B16小鼠黑素瘤细胞株（B16 cell）作为试验对象。在第一部分，取对数生长期的B16细胞，选择31.25、62.5、125、250、500μg/ml 5种浓度的熊果苷，甘草黄酮和内皮素拮抗剂作用72小时后，观察细胞大体形态变化，用MTT法检测三种药物对B16细胞增殖率的影响，比较药物的细胞毒性。实验第二部分，收获系列浓度梯度的三种药物处理后的B16细胞，台盼蓝染色计数活细胞
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 摘 要
数后，分别测定细胞酪氨酸酶活性和黑素含量。实验第三部分，选择0.5µg/ml内皮素，200µg/ml内皮素拮抗剂作用于细胞，以熊果苷为对照，观察内皮素对B16鼠黑素瘤细胞增殖的影响，检测细胞酪氨酸酶活性的变化，同时与内皮素拮抗剂组作比较，观察内皮素拮抗剂对内 皮素的特异性拮抗作用。
结果：实验第一部分的结果显示：甘草黄酮及熊果苷均能抑制细胞增殖，125μg/ml甘草黄酮作用48h，可见细胞分布稀疏，数量减少，增殖分化受到明显抑制，内皮素拮抗剂与空白对照组相比，细胞形态无特殊变化。用MTT比色法分别检测31.25、62.5、125、250和500µg/ml5种浓度甘草黄酮，熊果苷和内皮素拮抗剂对体外培养B16细胞增殖率的影响，结果发现，甘草黄酮随药物浓度的增加，对细胞增殖的抑制作用增加，甘草黄酮浓度在500μg/ml时，由于细胞毒性强，24h换液时，细胞全部脱落死亡。熊果苷浓度超过250μg/ml呈现明显的细胞增殖抑制。31.25~500µg/ml内皮素拮抗剂对细胞增殖率无明显抑制作用(p>0.05)。实验第二部分的结果显示：甘草黄酮能够显著抑制酪氨酸酶活性和黑素合成，且呈浓度依赖性，与空白对照组相比较，浓度为31.25、62.5、125、 250µg/ml的甘草黄酮作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为78.41% 、69.04%、 52.13% 、39.01%，黑素含量分别为81.70%、67.42%、58.39%、46.25%，甘草黄酮浓度在
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 摘 要
500μg/ml时，由于存活细胞数少，未测出。熊果苷显示有抑制黑素生成和抑制酪氨酸酶活性的作用，高浓度作用明显，但无明显浓度依赖性，与空白对照组比较，浓度为31.25、62.5、125、250和500µg/ml的熊果苷作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为90.19% 、78.03%、 56.45% 、63.72%和43.70%，黑素含量分别为87.69%、89.08%、74.86%、62.07%和33.78%，结果与甘草黄酮相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。新型内皮素拮抗剂单独作用于B16细胞，对其黑素合成和酪氨酸酶活性无明显作用。浓度为31.25、62.5、125、250和500µg/ml的内皮素拮抗剂作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为103.04% 、100.55%、 103.75% 、98.14%和96.30%，黑素含量分别为100.31%、98.33%、102.55%、99.97%和98.26%。实验第三部分的结果显示：单独加入内皮素0.5μg/ml作用48h，与空白组相比，细胞增殖加快，数量明显增多，酪氨酸酶活性升高(p<0.01)，说明内皮素有促进B16细胞增殖，提高酪氨酸酶活性，增加黑素生成的作用。同时加入内皮素拮抗剂200μg/ml，作用48h，细胞数量和酪氨酸酶活性未见明显升高。与内皮素组比较，差异有统计学意义(p<0.05)，说明内皮素拮抗剂具有拮抗内皮素的作用。对照组熊果苷与内皮素组相比，结果无统计学差异(p>0.05)。单独加入内皮素0.5μg/ml作用24h，细胞数量较空白组明显增多，再加入拮抗剂200μg/ml作用24h后，仍能
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 摘 要
显示酪氨酸酶活性降低(p<0.05)，说明即使先加入内皮素一段时间后再加拮抗剂，拮抗剂仍能对抗内皮素对酪氨酸酶活性的激活作用，使细胞酪氨酸酶活性恢复至空白对照水平左右。
结论：熊果苷和甘草黄酮证实均有抑制黑素生成的作用，甘草黄酮对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制，高浓度呈现细胞毒性。熊果苷对酪氨酸酶活性具有抑制作用，但没有明显的剂量－效应关系。对内皮素引起的酪氨酸酶活性升高，未见明显拮抗作用。提示黑素合成的调节机制复杂。内皮素拮抗剂对体外培养的黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成没有明显的作用。但能特异性抑制内皮素对黑素细胞分化和酪氨酸酶的激活作用,该内皮素拮抗剂200μg/ml即可拮抗0.5μg/ml内皮素的作用，使酪氨酸酶活性降低至正常水平附近。与甘草黄酮和熊果苷相比，细胞毒性较小。
关键词 B16细胞，细胞培养，黑素生成，甘草黄酮，熊果苷，内皮素 内皮素拮抗剂，酪氨酸酶
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 ABSTRACT
COMPARATIVE STUDIES ON REGULATION OF MELANOGENESIS IN THE RESPONSE OF MURINE MELANOMA CELLS TO ARBUTIN,
GLABRIDIN AND ET ANTAGONIST
ABSTRACT
Objectives: Melanin plays an important role in protecting human skin from the harmful effects of UV sun radiation.It determines our race and phenotypic appearance.The accumulation of an abnormal melanin amount in different specific parts of the skin as some pigmented patches
(melasma,ephelide,senile lentigines etc.)might become an esthetic problem yet.The management of acquired-hyperpigmentary skin disorders is still a hard challenge for dermatologists,because of the lack of univocal recommendationand on how those traditional hypopigmenting agents ,as well as the plant natural products produce their effects. In our study, glabridin、arbutin and ET antagonist were investigated in vitro for the action on tyrosinase activity,melanin content,and cell proliferation in
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 ABSTRACT
cultured B16 murine melanoma cells,in order to give an evaluation on the effectiveness and cytotoxicity of these three hypopigmenting agents. Method: B16 murine melanoma cells were used in this experiment.In the first part of experiment, B16 murine melanoma cells were incubated with 31.25,62.5,125,250,500μg/ml glabridin、arbutin and ET antagonist for 72h respectively. Rate of proliferation were measured by MTT. The cytotoxicity of glabridin、arbutin and ET antagonist were compared.In the second part of experiment, after incubated with 31.25,62.5,125,250,500μg/ml glabridin、arbutin and ET antagonist for 72h respectively.The melanin content and tyrosinase activity of B16 murine melanoma cells were measured.In the third part of experiment, 0.5µg/ml ET-1 and 200µg/ml antagonist were added into the cultured melanoma cells ,and the fluctuations of tyrosinase activity were observed and compared.
Results:Outcome of experiment one: Glabridin caused a marked change in cellular morphology,the cell body became small,with many elongate and thin cell processes.This effect was observed clearly at final concentration 125µg/ml after treating for 24 hours.Detecmination of cell proliferation rate showed that glabridin had marked inhibitory effect on cell proliferation rate at concentration 31.25~250 µg/ml, and distinguished cytotoxicity at concentration 500 µg/ml that all cells died out. Arbutin could markedly inhibit cell proliferation rate when the concentration over 250μg/ml and ET antagonist had no marked inhibitory effect on cell proliferation rate at concentration 31.25~500µg/ml. Outcome of experiment two: The results
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 ABSTRACT
showed that glabridin treatment inhibited melanin synthesis and tyrosinase activity significantly compared with control. Glabridin decreased the cellular melanin content in dose dependent manner. Compared with glabridin,arbutin treatment could also inhibited melanin synthesis and tyrosinase activity,but had not a concentration-dependent effect. ET antagonist had no marked inhibitory effect on melanin synthesis and tyrosinase activity.Outcome of experiment three: The results showed that the B16 murine melanoma cells treated with 0.5μg/ml ET-1 for 48h increased the activity of the tyrosinase and the cell proliferation rate significantly.But the treatment of the admixture of 0.5μg/ml ET-1 and 200μg/ml ET antagonist for 48h caused no marked change in cell proliferation rate and the tyrosinase activity compared with control.Furthermore, a treatment of 0.5μg/ml ET-1 for 24h,followed 200μg/ml ET antagonist for 24h also caused no remarkable change in the tyrosinase activity.
Conclusion: Both glabridin and arbutin exhibited an inhibitory effect on melanin production and tyrosinase activity in B16 murine melanoma cells. Glabridin inhibited tyrosinase activity in dose dependent manner and showed cytotoxicity at high concentration. ET-1 could increased the activity of the tyrosinase and the cell proliferation rate significantly. When treating B16 murine melanoma cells separately,ET antagonist showed no marked inhibitory effect on melanin production and tyrosinase activity.But it could particularly antagonize the effect of ET-1 in B16 murine melanoma cells and had little influence on B16 murine melanoma cell viability showing low cytotoxicity.
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KEY WORDS B16 murine melanoma cell， Melanogenesis，
Cell culture，Glabridin，Arbutin，ET-1and ET antagonist，Tyrosinase activity
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 英文缩略词表
英文缩略词表
ACTH adrenocorticotrophic hormone bFGF basic fibroblast grow factor cAMP cyclic adenosine monophosphate cGMP cyclic guanylic acid DMSO dimethyl sulphoxide DAG diacylglycerol
EDTA ethylenediamine tetraacetic acid ET endothelin FBS fetal bovine serum IFN interferon IL interleukin KC keratinocyte
L-dopa L-3,4-dihydroxyphenylalanine LT leukotriene MC melanocyte MTT
3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-
MSH melanocyte-stimulating hormones NGF nerve growth factor OD optical density PBS
bromide
-diphenyltetrazolium phosphate buffered saline
上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 英文缩略词表
PKA protein Kinase A PKC protein Kinase C SCF stem cell factor TYR tyrosinase
TRP-1 tyrosinase related protein 1 TRP-2 tyrosinase related protein 2 UVB ultraviolet light
VEGF vascular endothelial growth factor
上海交通大学医学院硕士学位毕业论文
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
引 言
皮肤的色素可以分为两大类：一类由自身产生，称之为内在色素，如黑素、含铁血黄素、胆色素等。另一类是外来的，称之为外来色素，如食物中的胡萝卜素，药物和重金属、异物等。
黑素是一种蛋白衍生物，在黑素细胞中通过酪氨酸酶等作用形成的黑素体，经黑素细胞的树枝状突分泌入临近的角质形成细胞，随着角质形成细胞的代谢（表皮细胞的向上移行），黑素体也不断向上转运，逐渐降解，最终脱落于皮面。这个过程是由无数结构单位--表皮黑素单位（epidermal melanin unit）来完成的。表皮黑素单位是由一个黑素细胞与其临近的约36个角质形成细胞共同组成[1] 。黑素包括优黑素和褐黑素，分别呈褐色和黄至红褐色，它们的吸收光谱较宽，能吸收整个可见光和紫外光；黑素使表皮皮肤呈黄褐色，褐色或黑色，它是决定肤色的最主要因素。黑素具有一系列重要功能：1)形成皮肤颜色，参与人类种族区别或动物保护色及性吸引；2)保护皮肤免受有害因素尤其是紫外线的辐射损害；3)清除有细胞毒性的自由基及氧化中间产物；4)与发育尤其是神经系统发育过程有关。
黑素细胞（melanocyte,MC）起源于神经嵴，在胚胎发育中通过间充质逐渐移行到表皮、毛囊、真皮、脉络膜、虹膜、软脑膜及某些血管周围等处。在这些组织内已成熟的黑素细胞具有形成黑素的能力。皮肤中的黑素细胞主要分布于表皮基层和毛球部位，且具有分泌黑素的能力。人表皮基层有10亿～20亿个黑素细胞，随部位而有密度差异，一般头面部较多，腹背部较少。这种密度分布相当恒定，无种族及性别差异。黑素细胞在光学显微镜下HE染色可见在基底细胞间或其正下方，胞核深染，电镜观察黑素细胞呈树枝状，可视为单细胞腺体，成熟的黑素颗粒可见于许多树枝状突上。
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
黑素合成是黑素细胞最重要的功能及分化特征。目前公认的黑素合成途经： 酪氨酸 多巴 多巴醌 多巴色素 二羟基吲哚 醌式吲哚 黑素，合成的黑素即称优黑素或真黑素，皮肤的色素主要由其组成。在黑素合成中，多巴醌还可通过另一途经经谷光甘肽或半胱氨酸催化生成褐黑素，但褐黑素在皮肤中的功效尚不了解[2] 。
在研究黑素合成的过程中，黑素合成机制一直是关注的焦点。黑素合成是一个由酪氨酸酶，多巴色素互变酶(Dopachrome tautomerase)和二羟基吲哚羧酸(DHICA)氧化酶参与的多步骤的酶促生化反应[3] ，有着复杂而精确的调控。现已知有很多环节参与了黑素合成的调控，包括黑素细胞中编码黑素合成相关酶和黑素小体基质蛋白基因转录；4个酪氨酸酶家族成员及酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2的翻译；酪氨酸酶翻译后加工和糖基化；黑素细胞中的囊泡融合形成黑素小体，成熟的酪氨酸酶转运进入黑素小体，从而启动黑素合成；调节酪氨酸酶家族成员的活性，黑素小体中Ph值以及SH基团的数目；黑素合成后的修饰及向周围角质形成细胞的转运；黑素小体在角质形成细胞中的降解。这些环节中任一靶点变化均可影响黑素合成。目前有关黑素合成的研究主要是围绕酪氨酸酶家族成员的调节展开的。酪氨酸酶是黑素合成的关键酶[4] ，该酶催化黑素合成早期限速步骤，即底物酪氨酸羟化和多巴氧化。黑素合成的速率与酪氨酸酶的量和活性直接相关。TRP-1和酪氨酸酶有着共同的催化活性，TRP-1的合成速率与黑素合成呈正相关。TRP-2催化多巴色素转化为5,6-二羟吲哚乙酸，催化黑素合成的后续步骤。翻译后的TYR，TRP-1 ，TRP-2糖基化过程都可以影响黑素合成。
分子生物学研究发现，体内外很多因子可能是通过黑素细胞膜表面受体进入细胞内，经下游信号传导来调控相应的靶点，引起细胞物质主要是蛋白质磷酸化或去磷酸化，对黑素细胞增殖、分化发挥调节作用。可能与黑素细胞增殖、分化有关的信号传导途经是：二脂酰甘油/蛋白激酶C(DAG/PKC)途经、一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(NO/cGMP/PKG)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联途经和环磷
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)途经。原癌基因c-kit编码c-kit受体，c-kit及其配体组成的细胞信号传导系统对黑素细胞的分化和生长有重要调控作用[5] 。具有调节作用的激素主要包括：促黑素细胞激素（melanocyte stimulating hormone,MSH）,促肾上腺皮质激素（ACTH）和雌激素。促黑素细胞激素及促肾上腺皮质激素可促进黑素细胞增殖，使黑素细胞树突增多，酪氨酸酶活性升高，黑素合成增加；在生理状态下，促肾上腺皮质激素对黑素合成的影响可能要比促黑素细胞激素的作用更大。雌激素与黑素细胞浆及胞核内的受体结合，使酪氨酸酶活性升高，黑素合成增加。机体中的许多细胞因子对黑素细胞的增殖分化都有影响。能促进黑素细胞生长，存活的因子有：碱性成纤维细胞生长因子（base fibroblast growth factor,bFGF）,内皮素（ET-1）,神经细胞生长因子（NGF）等；抑制黑素细胞增殖，是酪氨酸酶活性降低的有：白细胞介素-1a(IL-1a)，白细胞介素-6，肿瘤坏死因子等。此外，干细胞生长因子(SCF)能促进黑素细胞分化及黑素合成；干扰素（IFN）在一定条件下，能使黑素细胞形态改变，生长抑制；炎症介质白三烯C4(LTC4)是人黑素细胞的促分裂原，能引起黑素细胞快速增生，并对黑素细胞有趋化作用[6] 。
另外，体外许多物理（紫外线）和化学因素（石油类化合物）等，均可刺激黑素细胞增生，黑素合成增加，导致色素沉着性疾病。紫外线是人体长期接触的一个外界刺激因素.能引起黑素细胞增殖、促进黑素产生，出现皮肤色素沉着
[7,8]
。色素沉着是皮肤色素系统对外界环境的保护作用，黑素细胞是光谱保护作用
的靶细胞。研究发现紫外线可以直接刺激黑素细胞，使黑素细胞树突增多，酪氨酸酶活性升高，细胞内黑素总量增加。也可以通过促进角质形成细胞分泌内皮素-1,与黑素细胞表面的内皮素受体结合，刺激黑色素细胞增殖分化，并且激活酪氨酸酶的活性，提高黑素合成量[9] 。Romero-Graillet认为UVB诱导黑素生成可能是通过NO/cGMP/PKG信号途经调节细胞增殖与生长[10] 。也有研究认为紫外线可诱
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
发皮肤的活性氧族，使表皮内-SH基氧化。-SH基可与酪氨酸酶中的铜离子结合而产生抑制作用(酪氨酸酶是一种含铜需氧酶)，使黑素产生减少，反之则增加[11] 。
不同种族，皮肤的黑素含量明显不同，其波动范围从含量很低的高加索人种（Ⅰ型）一直到含量很高的非洲黑人（Ⅵ型）。黑素的多少，疏密和分布受种族，年龄，性别，部位，地理环境以及药物等因素影响。调查表明，生活在赤道附近的低纬度地区的人群，皮肤受到紫外线的辐射多，黑素量高，肤色较深；而在高纬度地区的人群，色素量低，肤色较淡。肤色还受内服药物和外用护肤品的影响。长期使用美白护肤品的皮肤颜色也会变亮。
有关研究显示75%中国女性和60%日本女性希望肤色白皙，随着经济的发展，生活水平的提高，女性对于自身皮肤的美容也给予了越来越多的关注，由于年龄增长，自然老化，环境因素等影响，表皮中过多的黑素使皮肤变暗从而带来各种美容问题，包括雀斑，黄褐斑，日光性角化以及炎症后色素沉着[12] 等，为了追求生活质量，适应交际需要，女性通过使用各类品牌的美白化妆品来达到美白皮肤的目的。近年来皮肤美白类化妆品市场日趋活跃，产品销售与日俱增，已成为护肤类化妆品的主流品种之一。美白剂作为美白化妆品的功能性原料因此受到极大关注，它的开发和应用研究不断深入，市场上新的功效高、易于配伍的原料不断推出。各国对皮肤美白剂作用、新的美白剂的开发和美白剂的应用投入了大量的人力、物力，并取得了明显的进展。目前已有许多皮肤美白剂问世，如早期的纯化学物氯化氨基汞、过氧化氢及氢醌，中期的果酸和近期的熊果苷、VitC衍生物、甘草提取物、曲酸及其衍生物等。
然而，美白剂作为外来物质，在干预皮肤黑素细胞的黑素合成功能，以达到美白皮肤目的的同时，也干扰了皮肤正常的生理功能，甚至产生皮肤损害[13] 。市售的美白产品花样繁多，其美白原理，众说不一，但都缺乏较严谨的科学依据。在美白剂的生产、使用过程中存在许多盲区，这包括常用美白物的功效和对黑素细胞的毒性不明确。目前我国还没有颁布实施美白化妆品功效评价程序，也缺少
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
对常用美白物质在皮肤黑素细胞毒性方面的检测，使得美白化妆品在投入市场前无肯定的、科学的功效检测报告及毒性评估，造成消费者选择化妆品的困难。化学美白剂效果较好，但不良反应较大；纯天然产物提取美白剂不良反应较轻，应用前景广泛，将是今后美白物质研发的热点方向之一。但天然美白剂的美白效果常常或小或不肯定，尚需进一步研究证实。
人们最早认识的皮肤脱色剂是分子结构与酪氨酸酶底物酪氨酸类似的单酚类
化合物氢醌[14] 。自1961年以来，氢醌成为最受欢迎的美白成分之一，但氢醌及其他酚类化合物的外用制剂化学性质不稳定易氧化变色，且有引起皮肤永久性白斑
的报告[15]，限制了这类药物的临床应用和开发。1988年日本学者Akiu等从杜鹃花
科植物熊果的叶中分离到一种具有脱色作用的单体化合物熊果苷，天然的β-糖苷对苯二酚[16~18] ，不仅抑制酪氨酸酶活性，还抑制黑素体成熟，还对DHICA多聚酶有作用，它温和的作用取决于在体内糖苷键水解，使对苯二酚缓慢释放。自此从药用植物中分离天然黑素生成调节剂开始引起人们广泛关注。
近年来，天然提取黄酮类物质因其安全有效，开始引起成为研究热点，约有4000余种从植物的茎叶花中提取物可以归入此类，其中很多具有抗色沉的作用，此类物质有白黎芦醇[19] ，儿茶素 ，没食子酸，芦荟苦素[20,21] 等，它们可以直接抑制酪氨酸酶活性，并作用于黑素生成的氧化过程中。有研究显示中药甘草提取活性成分对酪氨酸酶活性有明显抑制作用[22,23] ，其中甘草黄酮安全性好，对黑素
合成和酪氨酸酶活性有较强的抑制作用[24]。
随着全球市场的增长，需要更多安全性好，效果佳的新型天然美白成分用于治疗色素增加性疾病或添加到美白化妆品中，近年天然提取内皮素拮抗剂开始引起国内外研究者的广泛关注。
内皮素（ET）是迄今所知作用最强、持续最久的收缩血管的活性多肽。人体内的内皮素有3种，包括ET-1，ET-2和 ET-3，其中ET-1主要在内皮细胞内表达，通过旁泌方式调节局部血管紧张度。虽然已知内皮素对许多细胞具有不同的
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 引 言
作用，但因冠状动脉对内皮素的反应非常敏感，故关于内皮素的科研集中在心脏、血管用药方面。内皮素－1(ET-1)是一种21肽血管收缩肽，属于内皮素家族，1982年由日本学者首先发现，其效应主要由ETA和ETB两类受体介导，ETA和ETB受体是带有细胞特异性信号通路的跨膜G蛋白耦联受体家族中的成员。90年代初Joseph等研究发现角质形成细胞能合成和分泌ET-1。紫外线照射能促进其分泌。Hara等发现ET-1可促进培养黑素细胞树突数量增加，延长树突长度，呈剂量依赖性。推测ET-1可能是体内调节黑素细胞增殖及黑素合成的一个细胞因子。Imokawa等进一步实验证明人类黑素细胞具有高亲和性的ET-1受体，角质形成细胞分泌ET-1与黑素细胞膜上受体结合后，促进黑素细胞增殖并提高酪氨酸酶活性，从而使黑素合成增加。如果添加一种物质，能够对抗内皮素作用，就能够消除内皮素所带来的负面影响。这种物质就是所谓的内皮素拮抗剂。
内皮素拮抗剂的作用机理不同于传统意义上对于酪氨酸酶活性的抑制，是通过抑制内皮素对黑素细胞刺激增殖的调控来达到美白祛斑效果的。内皮素拮抗剂并非全新产物，在高血压、心脏病应用方面历史悠久，但是这一类心血管应用颇多的拮抗剂并非都能对皮肤旁泌的内皮素起作用，抑制黑素细胞的增殖[25] 。需要寻找到能被黑素细胞受体所接受的拮抗体，才能抑制内皮素对黑素细胞增殖分化的刺激作用。国外有研究报道有新型内皮素拮抗剂系天然春黄菊素提取物[26]，通过受体竞争性抑制作用拮抗ET-1介导的信号传导及酪氨酸酶活性升高，对UVB照射引起的色素沉着有明显的抑制作用。 近年，国内有报道从天然产物中分离得到的新型内皮素拮抗剂能有效地抑制内皮素对黑色素细胞的增殖刺激作用，具有热稳定，高效的特点[25] ，但作用机制尚未明确。
本研究通过建立体外培养B-16小鼠黑素瘤细胞模型，选择从天然成分中提取的常用美白剂熊果苷，甘草黄酮及新型内皮素拮抗剂，比较研究它们对细胞的增殖影响及细胞毒作用，以及对黑素细胞黑素合成和酪氨酸酶活性的影响，并探讨黑素合成机制，为天然提取美白成份的进一步研发和应用，提供思路和依据。
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 第一部分
纹身器材
第一部分
熊果苷、甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂对
B16小鼠黑素瘤细胞增殖的影响
皮肤美白是女性和美容研究领域的不懈追求，美白化妆品的开发是化妆品研究机构和化妆品公司的重要攻关方向。国外的化妆品研究机构及生产厂商投入大量的人力，物力进行美白产品的研究、开发，但是却不公开美白化妆品的有效成分的毒性和功效治疗。如果美白化妆品的种类、剂量选择不当，就有可能对使用者的皮肤造成损害，影响机体健康。目前国内尚缺少权威而详细的皮肤美白剂毒性的研究分析报告以及化妆品安全性测定评估。
由于氢醌等化学美白剂不良反应明显，临床应用受到限制，近年来，人们越来越青睐于使用维生素、矿物质以及传统中草药等植物提取物类天然成分.熊果苷和甘草黄酮是近年临床应用较多的天然提取类美白剂，因安全性好，疗效佳，受
到人们广泛关注。另外国内有报道[25]
从天然产物中分离得到的新型内皮素拮抗剂
通过抑制内皮素对黑色素细胞的增殖刺激作用，起到美白效果，应用前景广泛。
B16小鼠黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑素细胞培养比较困难的情况下，国外化妆品生产企业的科研单位，在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。
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纹身器材
为此，我们采用B16黑素瘤细胞株，以熊果苷、甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂为研究对象，观察这三种天然提取皮肤美白成份对B16细胞分化增殖的影响，评估它们的细胞毒性，为天然美白成份的研发和应用提供一些参考信息。
1.1 材料和方法
1.1.1 实验器材和试剂 实验主要设备
1．超净工作台（Laminar flow clean bench）：Boxun，SW-CJ-2D型，上海 博讯实业有限公司，中国
2．自动二氧化碳细胞培养箱：Thermo Forma C15302型，Thermo Fisher Scientific公司，美国
3．恒温振荡培养箱：THZ-98A型，上海一恒科学仪器有限公司，中国 4．普通台式离心机：Heraeus公司，美国
5．低温高速台式离心机：Allegra X-12R Centrifuge，BECKMAN公司，美国 6．精密天平：Mettler Toledo公司，瑞士
7．电热恒温水浴箱：HH.W21CU6000型，上海医疗器械厂 8．细胞计数仪：BECKMAN公司，美国
9．纯水系统：ZRQS 500 5Y 型，Millipore公司，瑞士 10．倒置相差显微镜：Nikon TS-100，日本
11. 全波长荧光/酶标扫描读数仪：Varioskan Flash型， Thermo Fisher Scientific公司，美国
12. 超低温（-80℃）冰箱：Thermo 8600系列，Thermo Fisher Scientific
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公司，美国 实验主要器材
1．电动移液器：Jencons公司，英国
2．连续可调式移液枪：1μl-1000μl，Eppendorf Research®型， Eppendorf公司，德国
3．离心管：15ml、50ml规格，FALCON公司，美国 4．培养皿：3.5cm、6cm、10cm规格，FALCON公司，美国 5．6孔培养板：FALCON公司，美国 6.96孔培养板：FALCON公司，美国
7．Millex无菌针头式过滤器：0.22μm 和0.45μm，SLGPR25LS, Millipore公司，瑞士
8．一次性无菌注射器：2ml、5ml、10ml、20ml、60ml规格，苏州林华医疗 器械有限公司，中国。
细胞分离和培养试剂：
1．RPMI1640培养液：GIBCO公司，美国
2．胎牛血清（FBS）：Cat.No.SH30088.3，HyClone公司，美国。在无血清 1640细胞培养液中加入胎牛血清至10%的终浓度 3．青霉素（Penicilin）：上海先锋药业公司，中国 4．链霉素（Streptomycin）：华北制药股份有限公司，中国 5．L-谷氨酰胺（L-glutamine）：Cat.No.G8540，SIGMA公司，美国 6．NaCl：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 7．MTT：Roche Molecular Biochemicals公司，德国
8．Na2HPO4·12H2O：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 9．KH2PO4：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 10．NaHCO3：分析纯，Cat.No.S5760，SIGMA公司，美国
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11．0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Trypsin-EDTA solution）:SIGMA公司，美 国，-20℃保存备用
12．0.4％台盼兰（Trypan blue）溶液：Cat.No.T8154，Sigma，美国 实验配制试剂
1．磷酸盐缓冲液（PBS）：
氯化钠（NaCl） 8g， 氯化钾（KCl） 0.2g， 磷酸氢二钠晶体（Na2HPO4·12H2O） 2.9g， 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g， 三蒸水 1000ml
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，经1.034× 105Pa高压蒸汽灭菌20分钟，4℃保存。 2．1640细胞培养液：
1640细胞培养基干粉（1L量）
L-谷氨酰胺 300mg， 抗坏血酸（维生素C） 50mg， 碳酸氢钠（NaHCO3） 3700mg， 青霉素 100000U， 链霉素 100000U， 三蒸水 1000ml，
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，0.22μm的无 菌滤器过滤除菌，4℃保存。 3．0.5%MTT溶液： MTT 250mg PBS 50ml
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加入50ml离心管混匀溶解，避光4℃保存备用。 药品
熊果苷，甘草黄酮，天然提取内皮素拮抗剂均由上海奥利实业有限公司提 供，其中甘草黄酮为脂溶性，以DMSO溶解，熊果苷和天然提取内皮素拮抗 剂为水溶性，用生理盐水新鲜配制。分别配成质量浓度为1g/L的贮液，-20℃ 保存，临用时用新鲜培养基调至终浓度。
1.1.2 实验方法
细胞培养：B16鼠黑素瘤细胞株购于中科院细胞所。待细胞生长至融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于10cm2培养皿中，用RPMI1640培养液，置于CO2培养箱，37℃，5% CO2，饱和湿度环境常规进行培养，每一次实验均取自同一传代细胞。
台盼蓝拒染细胞活力实验：制备单细胞悬液：用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液消化分离细胞，制成单细胞悬液。染色：取9滴各组细胞悬液移入试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液混匀。计数：3 分钟内用血球计数板在光镜下分别计数活细胞（未蓝染细胞）和死细胞(蓝染细胞)。
MTT法测定细胞增殖率[27]：取对数生长期的B16细胞，经消化分散制备单细胞悬液，计数，将细胞接种至96孔corning细胞培养板，接种密度为104/孔，液体量200µL/孔，过夜，待细胞贴壁，吸去培养液，用含有不同浓度处理因素（31.25,62.5,125,250,500µg/ml 5种浓度）的新鲜培养基换液1次，空白对照组仅加入培养液和相应溶媒，继续培养72h，药物处理结束时，每孔加5g/LMTT20µL，继续置CO2孵箱培养4h，然后吸去培养液，每孔加入200 µLDMSO，充分振摇培养板，用酶标仪测定每孔吸光度A490nm值，细胞增殖率以药物处理组A490/空白对照组A490×100表示。
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统计学分析：数据均以x±s 表示，采用单因素方差分析和配对 t 检验，统计过程使用SPSS11.0统计软件完成。
1.2 结果
1.2.1不同浓度的熊果苷对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响
从图1.1可见，用不同浓度的熊果苷作用于B16黑素瘤细胞，结果发现，熊果苷浓度在31.25、62.5、125、250和500μg/ml时，细胞的增殖率分别为99.53%,100.88%,87.50%,74.02%和43.28%，随着熊果苷剂量的增加，细胞增殖率降低，在熊果苷浓度超过250µg/ml呈现明显的细胞增殖抑制。
31.25 62.5
125 250 500 （μg/ml）
图1.1 熊果苷对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响
Figure 1.1 The Effect of Arbutin on the Viability of B16 Murine Melanoma Cells
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1.2.2不同浓度甘草黄酮对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响
31.25 62.5
125 250 500 （μg/ml）
图1.2 甘草黄酮对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响
Figure 1.2 The Effect of Glabridin on the Viability of B16 Murine Melanoma Cells
随药物浓度的增加，甘草黄酮对细胞增殖的抑制作用增加，呈现明显的剂量－效应关系，浓度为31.25、62.5、125、250μg/ml时，细胞的增殖率分别为91.27%,81.16%,51.04%,21.95%（见图1.2）,甘草黄酮浓度在500μg/ml时，由于细胞毒性强，24h换液时，细胞全部脱落死亡。
1.2.3不同浓度新型内皮素拮抗剂对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响 用不同浓度的新型内皮素拮抗剂作用于B16黑素瘤细胞，结果发现，在浓度高达500µg/ml时，细胞生长良好，其增殖不受内皮素拮抗剂的影响（见图1.3），内皮素拮抗剂浓度为31.25、62.5、125、250和500μg/ml时，细胞的增殖率分
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别为100.47%,101.04%,98.51%,99.11%和89.30%，与空白对照组之间没有统计学差异（p>0.05）。这些资料提示新型内皮素拮抗剂对B16小鼠黑素瘤细胞增殖无明 显影响。
31.25 62.5
125 250 500 （μg/ml）
图1.3 新型内皮素拮抗剂对B16鼠黑素瘤细胞增殖活性的影响
Figure 1.3 The Effect of ET antagonist on the Viability of B16 Murine Melanoma Cells
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1.2.4 熊果苷，甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂对B16细胞形态的影响
图1.4.1 空白对照组细胞 (×100)
Figure 1.4.1 B16 murine melanoma cells (the control) (×100)
图1.4.2 空白对照组细胞 (×40)
Figure 1.4.2 B16 murine melanoma cells (the control) (×100)
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图1.5.1 125μg/ml熊果苷处理组 (×100)
Figure 1.5.1 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml arbutin (×100)
图1.5.2 125μg/ml熊果苷处理组 (×40)
Figure 1.5.2 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml arbutin (×40)
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图1.6.1 125μg/ml甘草黄酮处理组 (×100)
Figure 1.6.1 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml glabridin (×100)
图1.6.2 125μg/ml甘草黄酮处理组 (×40)
Figure 1.6.2 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml glabridin (×40)
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图1.7.1 125μg/ml新型内皮素拮抗剂处理组 (×100)
Figure 1.7.1 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml ET antagonist (×100)
图1.7.2 125μg/ml新型内皮素拮抗剂处理组 (×40)
Figure 1.7.2 B16 murine melanoma cells incubated with 125μg/ml ET antagonist (×40)
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从B16黑素瘤细胞照片可见（图1.4、图1.5、图1.6和图1.7），实验第三天，对照组细胞生长良好，形态正常，加入熊果苷和甘草黄酮（125μg/ml），均可导致细胞分布稀疏，增殖分化受到抑制。125μg/ml新型内皮素拮抗剂处理组细胞形态及生长情况良好，B16细胞数量与空白对照组相比无明显差异，细胞增殖未受抑制。
1.3 讨论
皮肤主要由角质形成细胞（keratinocyte）,成纤维细胞(fibroblast),朗格罕氏细胞（Langerhans cell）及黑素细胞（melanocyte）等四种细胞组成。角质形成细胞构成皮肤的屏障，成纤维细胞合成的胶原蛋白构成皮肤的框架，朗格罕氏细胞具有免疫功能，黑素细胞通过合成黑素，使人类具有不同的肤色，黑素在表皮内，离皮肤表面50~100μm 。黑素包括优黑素和褐黑素，分别呈褐色和黄至红褐色。皮肤中的黑素可以吸收太阳中的紫外线，保护人体免受紫外辐射的损伤。
人类皮肤的着色包括结构性着色和功能性着色，结构性着色由遗传决定，不受外界环境的影响。功能性着色是在环境因素作用下，黑素合成在基础水平上的增加。如果黑素细胞合成的黑素过多或者分布不均匀，会导致各种色素增加性疾病。肤色深浅一直以来都被女性关注，特别是亚洲女性，尤为崇尚白皙肤色，随着生活水平的提高及人际交往的需要，使皮肤美白化妆品的需求不断增加。在商业利益的驱动下，国外的化妆品研究机构及生产厂商投入人力物力进行美白成分的开发，但是较少提及美白化妆品有效成分的毒性和功效资料。事实上，这些具有美白功效的外源性化学物美白皮肤的同时，也有可能损害护理部位的皮肤。美白化妆品消费者中已有发生副作用的报告[28,29,30]。
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B16小鼠黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑素合成功能与人体正常的皮肤黑素细胞基本一致，在人体皮肤黑素细胞的原代培养较为繁复的情况下，国外化妆品生产企业的科研单位，在筛选美白化学物的过程中，广泛采用该细胞株作为美白剂功效测定的受试细胞。为此，我们选择B16鼠黑素瘤细胞株作为测试对象，对美白剂对细胞的增殖活性影响进行检测，以评估其细胞毒作用，供临床应用和卫生监督部门参考。
美白化学物质是指可降低皮肤色度或减轻色素沉着，以达到皮肤美白为目的的天然或人工合成的化合物。氢醌使人们最早认识的皮肤脱色剂，上个世纪曾被广泛应用于临床治疗黄褐斑，雀斑等色素增加性皮肤病，但有报道其存在细胞毒作用和致突变作用[31,32],近年来，人们越来越青睐于使用维生素、矿物质以及传统中草药[33,34]等植物提取物类天然成分.熊果苷和甘草黄酮是近年临床应用较多，安全性较好的天然提取类美白剂，受到人们广泛关注，本研究选择新型内皮素拮抗剂与二者进行比较，评估三种药物对黑素细胞的增殖抑制作用，探讨其细胞毒性。检测结果显示（见图1.1,1.2,1.3）,熊果苷和甘草黄酮均可干扰培养的B16鼠黑素瘤细胞株细胞增殖，使细胞生长受到抑制。随着剂量的增加，B16细胞数量明显减少。甘草黄酮随药物浓度的增加，对细胞增殖的抑制作用增加，呈现明显剂量－效应关系，甘草黄酮浓度在500µg/ml时，由于细胞毒性强，24h换液时，细胞全部脱落死亡。熊果苷浓度超过250µg/ml呈现明显的细胞增殖抑制。 而新型内皮素拮抗剂在试验浓度31.25~500µg/ml对B-16黑素瘤细胞增殖率未见明显抑制作用(p>0.05)，细胞毒作用明显小于熊果苷和甘草黄酮。黑素细胞是一种具有树枝状突起的腺细胞，由于树枝突起试黑素细胞输送黑素颗粒的通道，同时也是与角质形成细胞联系的桥梁，因此，黑素细胞形态正常与否，对黑素细胞功能的发挥具有重要作用。从细胞照片可见（图1.4,1.5,1.6,1.7），125μg/ml熊果苷、甘草黄酮作用组B16黑素瘤细胞生长状况欠佳，在药物作用下，细胞呈散在分布，许多细胞孤立存在，细胞树状突起减少、缩短，细胞之间较难形成互相交通的网络结
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构，导致细胞不能通过网状互联结构进行旁分泌和细胞间隙通讯，以达到共同增殖分化，而且树状突起缩短或消失，导致黑素细胞不能与角质形成细胞构成一个有效的表皮单位，阻碍黑素的转运和代谢，不能实现黑素细胞的正常生理功能
[35]
。
由于培养所需条件相对简单，另外价格低廉，购买方便，使B16鼠黑素瘤细
胞株成为美白化学物研究开发的首选受试细胞，了解其是否与人皮肤黑素细胞存在差异以及差异的大小，对于新型美白剂的开发具有重要的现实意义，目前相关方面的文献报道较少。有实验表明两种细胞的基本结构和性能存在较大程度的相似性，但是两种细胞的敏感性和抗损伤能力是有差别的。与B16小鼠黑素瘤细胞株相比，人皮肤黑素细胞对美白化学物的损伤更为敏感[22]，所以，以B16鼠黑素瘤细胞株为测试对象筛选出的美白成分有可能对人体皮肤造成损害，提示我们以B16黑素瘤细胞株的研究结果外推到人时，要特别慎重。为此，今后在对于美白成分的进一步毒性检测中，以B16鼠黑素瘤细胞株的检测结果为参考，有条件应深入进行人皮肤黑素细胞的毒性试验，并以人体黑素细胞的检测结果为判断依据。
目前常用的美白成分主要是通过抑制酪氨酸酶活性和杀伤黑素细胞来达到美白皮肤的目的，但是这些美白成分的美白效果并不理想，因此人们一直希望开发新型高效低毒美白成分。因此我们选择天然提取新型内皮素拮抗剂作为尝试，从检测结果可见，新型内皮素拮抗剂在试验浓度31.25~500µg/ml，对B-16黑素瘤细胞增殖无干扰作用，细胞生长未受抑制，细胞形状状态良好，数量未见明显减少，表明该天然物质具有作为美白化妆品有效成分的潜力，因此有必要对其功效作进一步的检测和鉴定。
随着人们生活水平的提高，对皮肤白皙美丽状态的追求，美白化妆品的需求量逐年不断增加。然而这些具有美白功效的外源性化学物在美白皮肤的同时，也有可能损害护理部位的皮肤。理想的美白剂是通过抑制黑素细胞增殖，使细胞有
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序生长，来达到美白皮肤的目的，而不是通过大量杀死黑素细胞来达到美白目的。本次对熊果苷、甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂三种天然提取美白成分的研究结果表明，熊果苷和甘草黄酮可干扰体外培养的B16鼠黑素瘤细胞株细胞增殖，使细胞生长受到抑制。其中甘草黄酮对B16黑素瘤细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量－效应关系，而熊果苷浓度超过250µg/ml呈现明显的细胞增殖抑制。二者在高浓度均显示有细胞毒性，其中甘草黄酮在浓度为500μg/ml时，由于细胞毒性强，24h换液时，细胞全部脱落死亡。与熊果苷和甘草黄酮相比，新型内皮素拮抗剂的细胞毒作用较小，在试验浓度31.25~500µg/ml，新型内皮素拮抗剂对B16鼠黑素瘤细胞株细胞的增殖无明显影响，药物作用下的细胞生长良好，细胞数量未见明显减少，提示新型内皮素拮抗剂是一种更为安全的天然提取美白剂，其美白功效需要进一步实验和临床证实。 鉴于熊果苷和甘草黄酮的美白效果比较好，建议在美白化妆品中的使用剂量不宜太高。在美白剂的市场使用过程中，消费者要加强自我保护意识，注意所使用的美白化妆品的安全性。卫生监督和管理部门应该加强对市场出售美白化妆品的卫生安全监测，完善对化妆品中主要有效美白成分的毒性检测和分析，加大化妆品卫生安全知识的宣传，规范美白化妆品研发和使用市场，使化妆品能在充分发挥有效美白成分功效的同时，最大限度地减少对皮肤毒副作用的形成和发生。
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第二部分
熊果苷、甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂对B16鼠 黑素瘤细胞黑素含量和酪氨酸酶活性的影响
黑素细胞合成黑素[36]，经树枝状突起分泌到角质形成细胞内，在角质形成细胞溶酶体内降解，随表皮细胞的脱落而排出。黑素是决定皮肤和毛发颜色的最主要因素。黑素可以通过吸收日光中的紫外线和清除反应性活性氧从而保护皮肤免受紫外线等环境因素的损伤。黑素合成的数量和类型以及其在角质形成细胞周围的分布决定皮肤的实际颜色[37]。但是表皮中黑素过多或分布不均匀，会使皮肤变暗淡从而带来美容问题，形成色素增加性疾病包括黄褐斑、雀斑等。黑素合成是一个由酪氨酸酶，多巴色素互变酶(Dopachrome tautomerase)和二羟基吲哚羧酸(DHICA)氧化酶参与的多步骤的酶促生化反应，其中酪氨酸酶是黑素合成过程的关键酶[38]，避免日晒、抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素细胞代谢的物质均可以抑制黑素合成[39,40]。 目前已有许多皮肤美白剂问世，文献报道过很多药物或护肤品成分可以抑制酪氨酸酶活性，从而使皮肤变白[41]。自1961年以来，氢醌成为最受欢迎的美白成分之一[42,43],广泛应用于临床治疗色素增加性疾病，但有报道它可以引起细胞突变[44]，并导致永久性白斑发生，使用受到限制。近年来，人们越来越青睐于使用维生素、矿物质以及传统中草药等植物提取物类天然成分。相对于纯化学美白剂效果较好，但不良反应较大；天然产物提取美白剂不良反应较轻，应用前景广泛，将是今后美白物质研发的热点方向之一。但天然提取美白剂美白效果或小或不肯定，尚需进一步研究证实。熊果苷和甘草黄酮是近年临床应用较多，安全性较好的天然提取类美白剂，有报道天然提取新型内皮素拮抗剂作为美白剂，与一般抑制酪氨酸酶活性的美白剂相比，用量少，见效快，安全性佳,为了进一步验证天然提取美白物质对黑素细胞黑素合成的影响，我们以熊果苷、甘草
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黄酮和天然内皮素拮抗剂作用于培养的B16鼠黑素瘤细胞，比较观察三种美白剂对黑素合成和酪氨酸酶活性的影响，并探讨可能的作用机制。
2.1材 料 和 方 法
2.1.1 实验器材和试剂 实验主要设备
1．超净工作台（Laminar flow clean bench）：Boxun，SW-CJ-2D型，上 海博讯实业有限公司，中国
2．自动二氧化碳细胞培养箱：Thermo Forma C15302型，Thermo Fisher Scientific公司，美国
3．恒温振荡培养箱：THZ-98A型，上海一恒科学仪器有限公司，中国 4．普通台式离心机：Heraeus公司，美国
5．低温高速台式离心机：AllegraX-12R Centrifuge BECKMAN公司，美国 6．精密天平：Mettler Toledo公司，瑞士
7．电热恒温水浴箱：HH.W21CU6000型，上海医疗器械厂 8．细胞计数仪：BECKMAN公司，美国
9．纯水系统：ZRQS 500 5Y 型，Millipore公司，瑞士 10．倒置相差显微镜：Nikon TS-100日本 11．分光光度计：精密分析仪器有限公司
12．超低温（-80℃）冰箱：Thermo 8600系列 Thermo Fisher Scientific 公司，美国 实验主要器材
1．电动移液器：Jencons公司，英国
2．连续可调式移液枪：1μl-1000μl，Eppendorf Research®型， Eppendorf公司，德国
3．离心管：15ml、50ml规格，FALCON公司，美国
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4．培养皿：3.5cm、6cm、10cm规格，FALCON公司，美国 5．6孔培养板：FALCON公司，美国 6.96孔培养板：FALCON公司，美国
7．Millex无菌针头式过滤器：0.22μm 和0.45μm，SLGPR25LS, Millipore公司，瑞士
8．一次性无菌注射器：2ml、5ml、10ml、20ml、60ml规格，苏州林华医 疗器械有限公司，中国。 细胞分离和培养试剂：
1．RPMI1640培养液：GIBCO，Invitrogen公司，美国
2．胎牛血清（FBS）：Cat.No.SH30088.3，HyClone公司，美国。在无血 清1640 细胞培养液中加入胎牛血清至10%的终浓度 3．青霉素（Penicilin）：上海先锋药业公司，中国 4．链霉素（Streptomycin）：华北制药股份有限公司，中国 5．L-谷氨酰胺（L-glutamine）：Cat.No.G8540，SIGMA公司，美国 6．NaCl：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 7．KCl：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司
8．Na2HPO4·12H2O：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 9．KH2PO4：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 10．NaHCO3：分析纯，Cat.No.S5760，SIGMA公司，美国
11．0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Trypsin-EDTA solution）：Cat.No. T4049，SIGMA公司，美国，-20℃保存备用
12．0.4％台盼兰（Trypan blue）溶液：Cat.No.T8154，Sigma，美国 实验配制试剂
1．磷酸盐缓冲液（PBS）：
氯化钠（NaCl） 8g， 氯化钾（KCl） 0.2g，
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磷酸氢二钠晶体（Na2HPO4·12H2O） 2.9g， 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g， 三蒸水 1000ml
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，经1.034× 105Pa高压蒸汽灭菌20分钟，4℃保存。 2．1640细胞培养液：
1640细胞培养基干粉（1L量）
L-谷氨酰胺 300mg， 抗坏血酸（维生素C） 50mg， 碳酸氢钠（NaHCO3） 3700mg， 青霉素 100000U， 链霉素 100000U， 三蒸水 1000ml，
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，0.22μm的无菌 滤器过滤除菌，4℃保存。 药品
熊果苷，甘草黄酮，天然提取内皮素拮抗剂均由上海奥利实业有限公司提 供，其中甘草黄酮为脂溶性，以DMSO溶解，熊果苷和天然提取内皮素拮抗 剂为水溶性，用生理盐水新鲜配制。分别配成质量浓度为1g/L的贮液，-20℃ 保存，临用时用新鲜培养基调至终浓度。
2.1.2 实验方法
细胞培养：B16鼠黑素瘤细胞株购于中科院细胞所。 待细胞生长至近融合状态， 经0.25%胰蛋白酶和EDTA0.02%消化，用含有10%FBS的RPMI1640培养液（含100U/mL 青霉素，100µg/mL 链霉素）传代，置CO2孵箱37℃，5% CO2，饱和湿度环境常规进行培养，每一次实验均取自同一传代细胞，根据实验设计要求和培养皿规格选定细胞初始接种浓度为105/ml左右。细胞接种24小时后，用
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添加药物的新鲜培养基换液一次。继续孵育72小时后收获细胞，台盼蓝染色计数活细胞数，然后将细胞分为两份，分别用于酪氨酸酶活性和黑素含量测定。 实验分组：将质量浓度为1g/L的各药物用倍比稀释法分别稀释为
500,250,125,62.5,31.25µg/ml,空白对照组仅加入测试药物所用相应溶媒(DMSO或生理盐水)。
酪氨酸酶活性测定：参照Ando等报道的方法[45]并稍加改良。消化后收获细胞并进行细胞计数，离心后PBS洗2次，加入1.0ml裂解液（0.5%脱氧胆酸钠），振荡重悬，4℃放置1h，然后4℃离心(10000r/min)20min，获得含有酪氨酸酶的上清液。测定酪氨酸酶活性时，将1mL的上清液加入L-dopa反应液3.0mL（0.1%L-dopa，0.1mol/L PBS，pH6.8）中，37℃孵育20min，分光光度计测定反应生成的多巴色素的吸光度（A475nm），同时用L-dopa的自动氧化进行校正。酪氨酸酶活性以（药物处理组A475值/细胞数）/（空白对照组A475值/细胞数）×100来表示，每一处理因素重复测定3次。
黑素含量测定：参照文献的方法[46]，收获大约107细胞，台盼蓝染色计数活细胞，离心后PBS洗2次，加入 200µl三蒸水使沉淀悬浮，再加入1ml的乙醇：乙醚（1:1）混合液室温下静置20分钟，3000r/min离心5分钟，沉淀加入1mol/LNaOH1ml（含10%DMSO）,在80℃水浴中孵育30分钟，立即在475nm的分光光度计上测吸光度。黑素量以（药物处理组A475值/细胞数）/（空白对照组A475值/细胞数）×100来表示，每一处理因素重复测定3次。
统计学分析：数据均以x±s 表示，采用单因素方差分析和配对 t 检验，统计过程使用SPSS11.0统计软件完成。
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2.2 结果
2.2.1熊果苷对鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响
随着药物浓度的增高，熊果苷对鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的抑制率增加，但无明显浓度依赖性，与空白对照组比较，浓度为31.25、62.5、125、250和500µg/ml的熊果苷作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为90.19% 、78.03%、 56.45% 、63.72%和43.70%，黑素含量分别为87.69%、89.08%、74.86%、62.07%和33.78%，五种浓度的熊果苷对B16细胞酪氨酸酶活性和黑素含量均有抑制作用，高浓度抑制作用显著（表2.1,图2.1,图2.2）。
表2.1 熊果苷对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影响
组别(µg/ml) 酪氨酸酶活性 黑素含量
空白对照
100 100 31.25 90.19±11.17 87.69±2.88 62.5 78.03±4.13★★ 89.08±5.43★★
125 56.45±6.96★★ 74.86±4.88★★
250 63.72±5.07★★ 62.07±7.71★★
500 43.70±4.59★★ 33.78±8.16★★
酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分率表示 ★★
与空白对照组相比，p<0.01
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图2.1熊果苷对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
Figure 2.1 The effect of arbutin on the tyrosinase activity of B16 Murine Melanoma Cells
图2.2 熊果苷对B16黑素瘤细胞黑素含量的影响
Figure 2.2 The effect of arbutin on the melanin content of B16 Murine Melanoma Cells
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2.2.2甘草黄酮对鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响
甘草黄酮能够显著抑制B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成，作用呈浓度依赖性，与空白对照组相比较，浓度为31.25、62.5、125、 250μg/ml的甘草黄酮作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为78.41% 、69.04%、 52.13% 、39.01%，黑素含量分别为81.70%、67.42%、58.39%、46.25%，甘草黄酮浓度在500μg/ml时，由于存活细胞数少，未测出。实验浓度甘草黄酮对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成，均有十分明显的抑制作用，并呈现浓度依赖性，高浓度甘草黄酮呈现细胞毒性（表2.2,图2.3,图2.4）。
表2.2甘草黄酮对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素合含量的影响
组别(µg/ml) 酪氨酸酶活性 黑素含量
空白对照
100 100 31.25 78.41±2.07 81.70±8.31★★
62.5 69.04±2.49★★ 67.42±4.15★★
125 52.13±5.88★★ 58.39±5.05★★ 250 39.01±6.60★★ 46.25±5.38★★ 500 ND ND
酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分率表示 ★★
与空白对照组相比，p<0.01
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图2.3 甘草黄酮对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
Figure 2.3 The effect of glabridin on the tyrosinase activity of B16 Murine Melanoma Cells
图2.4 甘草黄酮对B16黑素瘤细胞黑素含量的影响
Figure 2.4 The effect of glabridin on the melanin content of B16 Murine Melanoma Cells
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2.2.3新型内皮素拮抗剂对鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的影响
在实验浓度，新型内皮素拮抗剂单独作用于B16黑素瘤细胞，对其酪氨酸酶活性和黑素含量无明显抑制作用，浓度为31.25、62.5、125、250和500µg/ml的内皮素拮抗剂作用72小时后，B16细胞酪氨酸酶活性分别为103.04% 、100.55%、 103.75% 、98.14%和96.30%，黑素含量分别为100.31%、98.33%、102.55%、99.97%和98.26%。显示新型内皮素拮抗剂与熊果苷和甘草黄酮作用机制不同，对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成无直接作用（表2.3,图2.5,
图2.6）。
表2.3 新型内皮素拮抗剂对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影响
组别(µg/ml) 酪氨酸酶活性 黑素含量
空白对照
100 100 31.25 103.04±25.57 100.31±11.11 62.5 100.55±10.99 98.33±8.66 125 103.75±1.89 102.55±6.40 250 98.14±10.39 99.97±8.78 500 96.30±8.98 98.26±8.89
酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分率表示
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图2.5 新型内皮素拮抗剂对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
Figure 2.5 The effect of ET antagonist on the tyrosinase activity of B16 Murine Melanoma Cells
图2.6 新型内皮素拮抗剂对B16黑素瘤细胞黑素含量的影响
Figure 2.6 The effect of ET antagonist on the melanin content of B16 Murine Melanoma Cells
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2.3 讨论
皮肤黑素细胞属腺细胞，具有树状突起，起源于胚胎神经嵴，随胚胎发育移行至表皮基底层，并通过树状突起，以1:36的比例与角质形成细胞构成一个表皮黑素单位。黑素细胞合成的黑素，经树枝状突起分泌到角质形成细胞内，在角质形成细胞溶酶体内降解，随表皮细胞的脱落而排出。黑素细胞合成色素的类型和数量以及其分布情况，决定了皮肤和毛发的颜色。当表皮中的黑素颗粒聚集过多或分布不均，就会出现色素增加性疾病。
黑素通过一系列氧化还原反应合成，其合成机制复杂，人们对黑素合成调控的认识经历了酪氨酸单酶学说到多酶学说，其中酪氨酸酶是目前黑素合成过程研究中较为集中的焦点。酪氨酸酶一种含有铜离子的单氧合酶，是黑素合成的关键酶，具有多态性[47,48]，在自然界中分布广泛，是黑素生物合成过程中的主要限速酶，研究发现，酪氨酸酶具有两种催化活性，即：酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase),催化底物酪氨酸生成多巴；多巴氧化酶(DOPA oxidase),催化多巴生成多巴醌(DOPA quinone) [49,50]。避免紫外线照射、使用皮肤脱色剂抑制酪氨酸酶的活性、抑制黑素细胞的代谢和增殖等均可以抑制黑素的生物合成。 目前已发现的皮肤脱色剂大多是通过抑制酪氨酸酶的活性来阻断黑素合成。通常酶抑制剂的作用方式是通过竞争性、非竞争性或混和性抑制酶活性，酶抑制剂的分子结构与底物类似，竞争性与酶结合，或者直接与酶催化基团或辅基结合，包括氢醌在内的一大类单酚化合物因其结构与底物酪氨酸类似而竞争性与酪氨酸酶结合，从而发挥酶抑制作用[51,52]，此外有些化合物能鳌合酪氨酸酶辅基Cu2+,使酶丧失活性[53]。对于色素增加性疾病，如黄褐斑，炎症后色素沉着等，治疗可以使用包括氢醌、维A酸、酪氨酸酶抑制剂等美白成分，在这些美白成分中，氢醌是人们最早发现的皮肤脱色剂，也是最受欢迎的美白成分之一，被广泛使用。但氢醌是一种潜在的细胞毒性成分，有报道它可以诱导突变，形成永久性白斑等不良反应，近年来使用受到限制，促使人们去发现能替代它的更安全有效
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的美白成分。化学美白剂脱色效果较好，但不良反应较大；近年来，人们越来越青睐于维生素、矿物质以及植物提取物等天然成分。这些天然提取美白成份不良反应较轻，在发挥美白功效的同时，安全性好，临床应用前景广泛。
目前，很多天然美白成分正在使用或处于研究阶段，临床应用比较广泛的是熊果苷[54]。1988年由日本学者Akiu等从杜鹃花科植物熊果的叶中首次分离得到。熊果苷是天然的β-糖苷对苯二酚，结构类似氢醌，美白效果较为肯定，同时，与氢醌不同，它温和的作用取决于结构上特殊的糖苷键在体内水解，使对苯二酚缓慢释放，在发挥美白功效的同时，安全性较好。熊果苷可以通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑素的合成[57]，用熊果苷处理过的黑素细胞，树突减少，黑素含量下降。本实验结果显示：熊果苷证实有抑制酪氨酸酶活性和黑素合成的作用。随着药物浓度增高，熊果苷对黑素细胞黑素合成的抑制作用增加。另外有研究显示，熊果苷不仅可以抑制酪氨酸酶活性，还抑制黑素体成熟，而且对黑素合成过程中另一个重要因素-DHICA多聚酶也有作用[58]，提示黑素合成机制的复杂性。 甘草为豆科植物甘草的根茎，含三萜皂甙类、黄酮类化合物。其中主要成分为甘草甜素和甘草次酸。在传统中药中，甘草具有祛痰、抗炎、抗变态反应、抗氧化、杀菌和美白[55]、抗氧化和清除自由基作用[56]。有研究显示甘草有抑制体外酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）和黑素瘤细胞黑素合成的作用[59,60],其中从甘草中提取的黄酮类物质对酪氨酸酶活性有较强抑制作用。约有4000余种从植物的茎叶花中提取物可以归入黄酮类物质，其中很多具有抗色沉的作用，包括白黎芦醇，儿茶素，没食子酸，芦荟苦素等，它们可以直接抑制酪氨酸酶活性，并作用于黑素生成的氧化过程中。为了进一步验证甘草对黑素细胞黑素合成的影响，我们以甘草黄酮作用于B16黑素瘤细胞，观察其对黑素的合成和酪氨酸酶活性的影响。本实验结果显示：甘草黄酮对黑素含量和酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制，与熊果苷比较，差异存在统计学意义(p<0.05)。但甘草黄酮高浓度呈现细胞毒性，浓度在500µg/ml时，由于细胞毒性强，24h换液时，细胞全部脱落死亡。因此作为美白剂使用时，应注意添加剂量。其美白作用机制还需要深入探讨。
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内皮素拮抗剂是近年来在国内外逐渐引起关注的一类新兴的美白剂。内皮素在紫外线照射引起的皮肤色沉中起了非常重要的作用。90年代初，日本Imokawa等人发现，角质形成细胞在紫外线的照射下会释放一种细胞分裂素，即内皮素，当它与黑素细胞的内皮素受体结合后，会刺激黑素细胞增殖分化，并且激活酪氨酸酶的活性，提高黑素合成量。内皮素拮抗剂通过竞争受体，阻止内皮素与其受体结合，从而阻断下游信号传导通路，阻止酪氨酸酶基因及细胞增殖相关基因激活表达，抑制黑素生成。但是，需要指出的是，并非任何一种内皮素拮抗剂都能抑制内皮素对黑素细胞的刺激增殖作用，必须找到能被黑素细胞受体所接受的拮抗体，才能抑制内皮素对黑素细胞增殖分化的刺激作用。
国外有研究报道有天然春黄菊素提取物，通过受体竞争性抑制作用拮抗内皮素受体介导的信号传导，抑制内皮素对黑素细胞酪氨酸酶的激活作用，减少黑素合成量。国内有报告利用生物高新技术，从天然产物中分离、酶解及纯化提取的新型内皮素拮抗剂能有效地抑制内皮素对黑素细胞的增殖刺激作用，具有色浅、高效、热稳定的优点。本实验结果显示：在实验浓度31.25~500µg/ml新型内皮素拮抗剂单独作用，对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量无明显影响。提示新型内皮素拮抗剂对培养的B16黑素瘤细胞黑素生成没有直接的抑制作用，其特异性拮抗内皮素对黑素细胞的刺激增殖作用需在下一部分实验中加以证实。 进入新世纪以来，随着生活水平的提高，人们开始注重自然美，追求消费品的天然特性，化妆品消费者更关心产品是否为天然产物及其安全性。为此世界上美白物质的生产和研究机构均在努力寻找天然的美白化妆品有效成分。Dooley[61]提出了开发新的皮肤美白成分的总的原则，理想的美白成分应该通过特异性减少酪氨酸的合成或抑制酪氨酸[62]的活性从而抑制黑素小体内黑素的合成，同时具有细胞毒性低和无诱导突变的作用。
本研究结果显示，天然提取美白剂不良反应相对较轻，安全性好，是当前以及今后美白物质研发的热点方向之一。其功效和作用机制方面有待进一步实验及临床证实。
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第三部分 新型内皮素拮抗剂对由内皮素引起的 B16细胞增殖及酪氨酸酶活性变化的拮抗作用
皮肤衰老主要分为自然衰老和光老化两种[63]。光老化是指皮肤衰老过程中光损害的积累，即除了自然衰老外，光线，主要是紫外线辐射所造成的损伤。紫外线(UV)尤其是中波紫外线(UVB)的辐射，可使弹力纤维变性，受紫外线辐射(UVR)的皮肤自由基增加，促使皮肤加速老化，主要表现为皮肤红斑、色素沉着、破坏其保湿能力，促使其粗糙、多皱。而长波紫外线(UVA)虽然在紫外线中所占比例少，但其穿透力强、剂量高于UVB，可使皮肤晒黑[64]。
皮肤中约有40万个黑素细胞，通过致密斑与基底膜相连。并通过树状突起，以1:36的比例与角质形成细胞构成一个表皮黑素单位。黑素细胞具有形成、分泌黑素的功能，黑素使决定皮肤和毛发颜色的主要色素。Herlyn认为MC可能生存在一个由未分化的基底层KC细胞、KC细胞衍生细胞因子、基底层成份、细胞黏附分子、细胞外基质等多种因素构成的特定复杂的微环境中，任何不利的因素都可影响其增殖分裂、黑素形成、移行和存活等行为[65]。
色素沉着是皮肤色素系统对外界环境的保护作用。黑素细胞是光谱保护作用的靶细胞。研究表明，紫外线为一外源性的促细胞分裂剂，能引起黑素细胞的增殖及黑素产生，出现皮肤色素沉着[66,67]。还有实验证明UVB不仅直接刺激黑素细胞，而且还可激活KC细胞中内皮素-1、白介素-L高表达，而内皮素-1、白介素-L可促进MC增殖，提高酪氨酸酶活性，增加DNA合成[68,69]，调节MC对紫外线照射的反应。同时有实验证实在黑色素细胞培养液中加入特异性的抗内皮素抗体后(即内皮素拮抗剂)，能抑制紫外线对黑色素细胞的增生刺激作用，并降低内皮素含
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量。血清检测表明，色素沉着患者体内整体内皮素含量比正常人高，色斑局部组织角朊细胞内皮素含量比正常组织高。这些新的研究成果为我们治疗色斑时，全身和局部使用皮素拮抗剂提供了一定的科学依据。同时也表明色斑的形成原因很复杂，可能还有其它许多因素未被探知。为此，本研究希望深入证实内皮素对黑素细胞增殖分化的刺激作用以及新型内皮素拮抗剂对其的拮抗抑制效应，为内皮素拮抗剂作为新型、安全有效的美白剂应用于临床提供实验室依据。
3.1材 料 和 方 法
3.1.1 实验器材和试剂 实验主要设备
1．超净工作台（Laminar flow clean bench）：Boxun，SW-CJ-2D型，上 海博讯实业有限公司，中国
2．自动二氧化碳细胞培养箱：Thermo Forma C15302型，Thermo Fisher Scientific公司，美国
3．恒温振荡培养箱：THZ-98A型，上海一恒科学仪器有限公司，中国 4．普通台式离心机：Heraeus公司，美国
5．低温高速台式离心机：AllegraX-12R Centrifuge，BECKMAN公司，美国 6．精密天平：Mettler Toledo公司，瑞士
7．电热恒温水浴箱：HH.W21CU6000型，上海医疗器械厂 8．细胞计数仪：BECKMAN公司，美国
9．纯水系统：ZRQS 500 5Y 型，Millipore公司，瑞士 10．倒置相差显微镜：Nikon TS-100日本 11．分光光度计：精密分析仪器有限公司，上海
12. 液氮罐：Thermo(Forma)CMR 系列Cat.No.8120，Thermo Fisher
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Scientific公司，美国 实验主要器材
1．电动移液器：Jencons公司，英国
2．连续可调式移液枪：1μl-1000μl，Eppendorf Research®型， Eppendorf公司，德国
3．离心管：15ml、50ml规格，FALCON公司，美国 4．培养皿：3.5cm、6cm、10cm规格，FALCON公司，美国 5．6孔培养板：FALCON公司，美国 6.96孔培养板：FALCON公司，美国
7．Millex无菌针头式过滤器：0.22μm 和0.45μm，SLGPR25LS, Millipore公司，瑞士
8．一次性无菌注射器：2ml、5ml、10ml、20ml、60ml规格，苏州林华医疗 器械有限公司，中国。 细胞分离和培养试剂：
1．RPMI1640培养液：GIBCO，Invitrogen公司，美国
2．胎牛血清（FBS）：Cat.No.SH30088.3，HyClone公司，美国。在无血清 1640 细胞培养液中加入胎牛血清至10%的终浓度 3．青霉素（Penicilin）：上海先锋药业公司，中国 4．链霉素（Streptomycin）：华北制药股份有限公司，中国 5．L-谷氨酰胺（L-glutamine）：Cat.No.G8540，SIGMA公司，美国 6．NaCl：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 7．KCl：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司
8．Na2HPO4·12H2O：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 9．KH2PO4：分析纯，中国药业集团上海化学试剂有限公司 10．NaHCO3：分析纯，Cat.No.S5760，SIGMA公司，美国
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11．0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Trypsin-EDTA solution）：Cat.No.T4049， SIGMA公司，美国，-20℃保存备用
12．0.4％台盼兰（Trypan blue）溶液：Cat.No.T8154，Sigma，美国 实验配制试剂
1．磷酸盐缓冲液（PBS）：
氯化钠（NaCl） 8g， 氯化钾（KCl） 0.2g， 磷酸氢二钠晶体（Na2HPO4·12H2O） 2.9g， 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g， 三蒸水 1000ml
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，经1.034× 105Pa高压蒸汽灭菌20分钟，4℃保存。 2．1640细胞培养液：
1640细胞培养基干粉（1L量）
L-谷氨酰胺 300mg， 抗坏血酸（维生素C） 50mg， 碳酸氢钠（NaHCO3） 3700mg， 青霉素 100000U， 链霉素 100000U， 三蒸水 1000ml，
加入烧杯中混合摇匀，充分溶解后，调整PH值约为7.2，0.22μm的无 菌滤器过滤除菌，4℃保存。 药品
内皮素(ET-1)购自美国sigma公司。熊果苷，天然提取内皮素拮抗剂均由上 海奥利实业有限公司提供
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熊果苷和天然提取内皮素拮抗剂为水溶性，用生理盐水新鲜配制。
2.1.2 实验方法
B16细胞培养：B16鼠黑素瘤细胞株购于中科院细胞所。 待细胞生长至近融合状态， 经0.25%胰蛋白酶和EDTA0.02%消化，用含有10%FBS的RPMI1640培养液（含100U/mL 青霉素，100µg/mL 链霉素）传代，置CO2孵箱37℃，5% CO2，饱和湿度环境常规进行培养。
内皮素拮抗试验：B16细胞培养传代，取同一传代细胞，接种至6孔corning细胞培养板，接种密度为105/孔，分两组。A组：待细胞贴壁后，吸去培养液，分别用含0.5μg/ml内皮素的新鲜培养基，0.5μg/ml内皮素200μg/ml内皮素拮抗剂的混和培养液和0.5μg/ml内皮素200μg/ml熊果苷的混和培养液换液，培养48h后，按前述方法对各组进行酪氨酸酶活性测定。B组：待细胞贴壁后，吸去培养液，用含0.5μg/ml内皮素的新鲜培养基换液，24h后分别用含0.5μg/ml内皮素的新鲜培养基， 200μg/ml内皮素拮抗剂的培养基和200μg/ml熊果苷的培养基换液，继续培养24h后按前述方法对各组进行酪氨酸酶活性测定。空白对照组加入培养液和相应溶媒。
数据处理：数据均以x±s表示，采用单因素方差分析和配对 t 检验，统计过程使用SPSS11.0统计软件完成。
2.2 结果
3.2.1 内皮素拮抗剂能特异性抑制内皮素对B16细胞分化和增殖的刺激促进作用。
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单独加入内皮素0.5μg/ml作用48h，与空白组相比，细胞增殖加快，数量显著增多，说明内皮素有促进B16细胞增殖的作用。同时加入内皮素拮抗剂200μg/ml，作用48h，细胞数量未见明显增加，说明内皮素拮抗剂能抑制内皮素对B16细胞的促增殖作用。对照组熊果苷与内皮素组相比无明显差异(图2.1A组)。 单独加入内皮素0.5μg/ml作用6h，细胞增殖加快,数量与空白对照组相比即有增多，作用24h后，细胞数量比空白对照组明显增多。说明内皮素可以快速显著刺激B16黑素瘤细胞的增殖、分化。再加入拮抗剂200μg/ml作用24h后，能拮抗内皮素的促增殖作用，抑制细胞进一步的增殖速率。对照组熊果苷对内皮素无明显拮抗作用(图2.1B组)。
3.2.2 内皮素拮抗剂能特异性抑制内皮素对B16细胞酪氨酸酶的激活作用。
单独加入内皮素0.5μg/ml作用48h，酪氨酸酶活性升高，与空白对照组相比，差别有统计学意义(p<0.01)，说明内皮素能明显提高酪氨酸酶活性，增加黑素生成。同时加入内皮素拮抗剂200μg/ml，作用48h，酪氨酸酶活性未见明显升高。与内皮素组比较，差异有统计学意义(p<0.05)(表2.1 A组)，说明内皮素拮抗剂能抑制内皮素对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶的激活作用。对照组熊果苷与内皮素组相比无统计学意义(p>0.05)(图2.2A组)。
单独加入内皮素0.5μg/ml作用24h，再加入拮抗剂200μg/ml作用24h后，仍能显示酪氨酸酶活性降低(p<0.05)(表2.2 B组)，说明即使先加入内皮素一段时间后再加拮抗剂，拮抗剂仍能拮抗内皮素对酪氨酸酶活性的激活作用，使细胞酪氨酸酶活性恢复至空白对照水平左右(图2.2B组)。
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图2.1 内皮素拮抗剂能特异性抑制内皮素对B16细胞分化和增殖的刺激促进作用 A组：
空白组： 仅加入培养液 内皮素组：内皮素0.5μg/ml
拮抗剂组：内皮素0.5μg/ml＋新型内皮素拮抗剂200μg/ml 熊果苷组：内皮素0.5μg/ml＋熊果苷200μg/ml
(图2.1 A1)
接种时各组细胞 (×40)
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纹身器材
(图2.1 A2)
接种时各组细胞 (×100)
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(图2.1 A3)
药物作用后24h (×40)
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(图2.1 A4)
药物作用后24h (×100)
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(图2.1 A5)
药物作用后48h (×40)
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(图2.1 A6)
药物作用后48h (×100)
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B组： (图2.1 B1)
内皮素0.5μg/ml 作用6h (×40)
内皮素0.5μg/ml 作用6h (×100)
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(图2.1 B2)
内皮素0.5μg/ml 作用24h (×40)
内皮素0.5μg/ml 作用24h (×100)
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(图2.1 B3)
空白组： 仅加入培养液 作用48h 内皮素组：内皮素0.5μg/ml 作用48h
拮抗剂组：内皮素0.5μg/ml作用24h＋新型内皮素拮抗剂200μg/ml作用24h 熊果苷组：内皮素0.5μg/ml作用24h＋熊果苷200μg/ml作用24h
(×40)
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(×100)
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表2.1 内皮素拮抗剂对内皮素引起的B16细胞酪氨酸酶 活性升高的拮抗作用(以熊果苷为对照) (x±s,%)
A组
内皮素
内皮素+拮抗剂 97.60±4.01▼
内皮素+拮抗剂（24h后加入）
99.20±3.09▼
内皮素+熊果苷 106.52±2.95★★
内皮素+熊果苷（24h后加入）
109.25±6.08★★
酪氨酸酶活性 107.54±2.42★★
B组
内皮素
酪氨酸酶活性 109.74±5.45★★
注：酪氨酸酶活性以处理组占空白对照组A值的百分率表示；空白对照组相应值设定为100%；与空白对照组相比，
★★
p<0.01；与内皮素组相比，▼p<0.01；n =3
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图2.1(A组) 内皮素拮抗剂对内皮素引起的B16细胞酪氨酸酶活性升高的拮抗作用 内皮素：内皮素0.5μg/ml 作用48h
内皮素＋拮抗剂：内皮素0.5μg/ml＋新型内皮素拮抗剂200μg/ml 作用48h 内皮素＋熊果苷：内皮素0.5μg/ml＋熊果苷200μg/ml 作用48h 空白对照组酪氨酸酶活性设定为100%
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图2.1(B组) 内皮素拮抗剂对内皮素引起的B16细胞酪氨酸酶活性升高的拮抗作用 内皮素：内皮素0.5μg/ml 作用48h 内皮素＋拮抗剂：内皮素0.5μg/ml作用24h
＋新型内皮素拮抗剂200μg/ml作用24h 内皮素＋熊果苷：内皮素0.5μg/ml作用24h ＋熊果苷200μg/ml作用24h 空白对照组酪氨酸酶活性设定为100%
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2.2 讨论
衰老是指随着时间的推移所有个体都将发生的功能性和器质性逐渐衰退的过程。这种退行性的变化可归因于内源性（基因调控）和个体反复受外源性环境中各种有害因素影响的综合作用结果。
皮肤衰老主要分为自然衰老和光老化两种。而光老化(photoaging)是指皮肤衰老过程中紫外线损害的积累结果[70]。人体的皮肤每天都接受着来自日光中紫外线的辐射，长期的紫外线辐射将导致皮肤光老化，表现为皮肤粗糙、松弛、下垂，出现皱纹和色斑，甚至良性或恶性肿瘤等。近年来随着空气污染所致的臭氧层变薄，紫外线更易通过大气层，从而加重暴露皮肤的光损伤。研究表明，紫外线为一种外源性促细胞分裂剂，能明显提高黑素细胞酪氨酸酶活性，促进黑素合成，使黑素体迅速向角质层传递，出现皮肤色素沉着。色素沉着是皮肤色素系统对外界环境的保护作用，黑素细胞是光谱保护作用的靶细胞。皮肤黑素通过对紫外线的吸收、散射等效应，起着抵御日光紫外线照射的作用，但同时使暴露部位皮肤颜色加深，色素沉着明显，皮肤粗糙，皱纹加深、加粗，加速皮肤的衰老。 有人研究发现紫外线照射后，花生四烯酸，前列腺素D2 ,前列腺素E2 等明显增加。前列腺素E2 能使小鼠黑素细胞增加，前列腺素D2使培养的能黑素细胞及其树突增大，表现为黑素细胞增多，细胞合成黑素能力及酪氨酸酶活性增加[71]。也有人认为紫外线可诱发皮肤的活性氧族，使表皮内-SH基氧化。-SH基可与酪氨酸酶中的铜离子结合而产生抑制作用(酪氨酸酶是一种含铜需氧酶)，使黑素产生减少，反之则增加[72]。同时，有研究证明紫外线除了直接刺激黑素细胞，另一方面，还可激活角质形成细胞(KC)表达和分泌内皮素－1(ET-1)，当ET-1被黑色素细胞表面的受体接受后, 会刺激黑色素细胞增殖、分化, 并且激活酪氨酸酶的活性, 提
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高黑色素的合成量。血清检测表明，色素增加性疾病患者体内整体内皮素含量比正常人高，色斑局部组织角质形成细胞内皮素含量比正常组织高。
内皮素（ET）是迄今所知作用最强、持续最久的收缩血管的活性多肽。虽然已知内皮素对许多细胞具有不同的作用，但因冠状动脉对内皮素的反应非常敏感，故关于内皮素的科研集中在心脏、血管用药方面。内皮素－1(ET-1)是从内皮细胞中分离出来的一种21肽血管收缩肽，属于内皮素家族，1982年由日本学者首先发现，其效应主要由ETA和ETB两类受体介导，ETA和ETB受体是带有细胞特异性信号通路的跨膜G蛋白耦联受体家族中的成员。90年代初Joseph等研究发现角质形成细胞能合成和分泌ET-1。紫外线照射能促进其分泌。Hara等发现ET-1可促进培养黑素细胞树突数量增加，延长树突长度，呈剂量依赖性[73]。推测ET-1可能是体内调节黑素细胞增殖及黑素合成的一个细胞因子。Imokawa[74]等进一步实验证明人类黑素细胞具有高亲和性的ET-1受体，角质形成细胞分泌ET-1与黑素细胞膜上受体结合后，促进黑素细胞增殖并提高酪氨酸酶活性，从而使黑素合成增加。同时有实验证实在黑色素细胞培养液中加入特异性的抗内皮素抗体后(即内皮素拮抗剂)，能抑制紫外线对黑色素细胞的增生刺激作用，并降低内皮素含量。但是，并非任何一种内皮素拮抗剂都能抑制内皮素对黑素细胞的刺激增殖作用，必须找到能被黑素细胞受体所接受的拮抗体，才能抑制内皮素对黑素细胞增殖分化的刺激作用。近年来，随着生活水平的提高，美白成份的安全性开始受到关注，人们越来越青睐于使用维生素、矿物质以及传统中草药等植物提取物类天然成分。近年国外有研究报道有天然春黄菊素提取物[61]，通过受体竞争性抑制作用拮抗内皮素受体介导的信号传导，抑制内皮素对黑素细胞酪氨酸酶的激活作用，减少黑素合成量。本实验所用新型内皮素拮抗剂系利用生物高新技术从天然水生生物中分离、酶解及纯化得到，能有效地抑制内皮素对黑素细胞的增殖刺激作用，具有色浅、高效、热稳定的优点。国内外尚未见文献报道此种活性成份。在前两部分实验中发现实验浓度31.25~500µg/ml新型内皮素拮抗剂单独作用，对
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B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量无明显影响，且细胞毒性较小，提示新型内皮素拮抗剂与传统美白药物作用机理不同，对培养的B16黑素瘤细胞黑素生成没有直接的抑制作用，对细胞增殖也没有明显的影响，安全性好。
Imokawa试验证明内皮素不仅能刺激黑素细胞产生黑素，同时也是黑素细胞分裂原，内皮素拮抗剂通过竞争受体，阻止内皮素与其受体结合，从而阻断下游信号传导通路，阻止酪氨酸酶基因及细胞增殖相关基因激活表达，
本部分实验结果显示：虽然新型内皮素拮抗剂对体外培养的B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成无明显直接作用，但该内皮素拮抗剂200μg/ml即可拮抗0.5μg/mlET-1对黑素瘤细胞的刺激增殖作用，48h测定酪氨酸酶活性与空白对照组相比，无明显变化(p>0.05)，显示具有特异性抑制ET-1对黑素细胞分化和酪氨酸酶的激活作用，提示拮抗剂可能取代内皮素与其受体结合，从而阻断受体耦联信号传导。本实验中，0.5μg/mlET-1作用24h后,再加入200μg/ml拮抗剂作用24h，酪氨酸酶活性与空白对照组相比，未见明显升高(p>0.05)，提示拮抗剂与ET-1受体的结合能力可能比ET-1与其受体结合能力更强，使内皮素从结合部位解离，切断信号传导途经，活化的基因失活。提取自天然杜鹃花科植物熊果的传统美白物熊果苷，能抑制黑素生成，安全性好[75]，临床应用广泛，但在本实验中对内皮素无明显拮抗作用。内皮素拮抗剂并非全新产物，在高血压等心血管疾病应用方面历史悠久，并非任何一种拮抗剂都能抑制黑素细胞的增殖，其原因尚未明确。
B16鼠黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑素细胞培养比较困难的情况下，价格便宜、来源广泛的B16细胞株成为国外化妆品生产企业的科研单位首选受试细胞，故本实验选择其作为受试对象，进行美白成份功效的初步测定评价。在今后进一
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步的研究中，有条件可以进行人皮肤黑素细胞为受试对象的试验，更好地为药物的临床应用提供依据。
本实验证实内皮素(ET-1)可使培养鼠B16黑素瘤细胞树突数量增加，延长树突长度。能显著刺激B16细胞增殖、分化并提高酪氨酸酶活性，使黑素生成增加。本实验所用新型内皮素拮抗剂系利用生物高新技术从天然水生生物中提取得到，能特异性拮抗内皮素对鼠B16黑素瘤细胞的刺激增殖作用，高效快速，同时，对B16细胞本身没有杀伤作用，细胞毒性小，是一种安全有效的皮肤美白剂，在UV照射或其他原因引起的由于ET-1增高导致的皮肤色素增加性疾病中，具有广泛的应用前景，其作用机理有待进一步研究。
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 全文总结
全 文 总 结
本研究建立体外培养B-16小鼠黑素瘤细胞模型，首先观察比较了天然提取美白成份熊果苷，甘草黄酮和新型内皮素拮抗剂对B16细胞黑素合成的影响，结果发现熊果苷和甘草黄酮证实均有抑制B16细胞黑素生成的作用，熊果苷和甘草黄酮均可干扰培养的B16鼠黑素瘤细胞株细胞增殖，使细胞生长受到抑制。甘草黄酮对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量呈浓度依赖性抑制，高浓度呈现细胞毒性。随着药物浓度的增加，熊果苷对B16细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的抑制作用增加，但没有明显的浓度依赖性，可能还影响DHICA多聚酶等其他酶或途经，抑制黑素小体的成熟，提示黑素合成的调节机制复杂。新型内皮素拮抗剂在试验浓度31.25~500µg/ml对B-16黑素瘤细胞的增殖无明显的影响，提示其无明显的细胞毒性。同时研究结果显示新型内皮素拮抗剂单独作用，对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素含量无明显影响，提示其作用机制与熊果苷和甘草黄酮不同。
在此基础上，本课题观察了新型内皮素拮抗剂对内皮素引起的B16细胞增殖及酪氨酸酶活性变化的拮抗作用，结果发现内皮素（ET-1）能显著刺激B16细胞增殖、分化，并且激活酪氨酸酶的活性，提高黑素合成量。新型内皮素拮抗剂200μg/ml即可拮抗0.5μg/mlET-1对黑素瘤细胞的刺激增殖作用， 48h测定酪氨酸酶活性与空白对照组相比，无明显变化，显示该内皮素拮抗剂具有特异性抑制ET-1对黑素细胞分化和酪氨酸酶的激活作用，提示拮抗剂可能取代内皮素与其受体结合，从而阻断受体耦联信号传导。进一步实验发现，0.5μg/mlET-1作用24h后,再加入200μg/ml拮抗剂作用24h，酪氨酸酶活性与空白对照组相比，未见明显升高，提示拮抗剂与ET-1受体的结合能力可能比ET-1与其受体结合能力更强，使内皮素从结合部位解离，切断信号传导途经，活化的基因失活。皮肤受到紫外线辐射后，角质形成细胞分泌ET-1增加，与其位于黑素细胞表面的受体结合后，促
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上海交通大学医学院硕士学位毕业论文 全文总结
进黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性，本研究用新型内皮素拮抗剂系天然水生生物提取物可以特异性拮抗内皮素的促黑素合成作用，高效快速，安全性好，作为新型美白成份，在UV照射或其他原因引起的由于ET-1增高导致的皮肤色素增加性疾病中，具有广泛的应用前景，其作用机理有待进一步研究。
黑素合成是一个多步骤的酶促生化反应，有着复杂而精确的调控，使用复合的美白剂将是开发新一代美白化妆品的方向。
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附 录
综 述
角质形成细胞在色素增加性疾病中的作用研究进展
摘要：色素增加性皮肤病是指在表皮和/或真皮内的色素增加，是一类常见的影响美容的疾病。表皮黑素单位为一多细胞结构功能单位。角质形成细胞(KC)通过旁分泌因子,细胞-细胞间连接增强黑素细胞(MC)的生长、增殖、树突的生长以及黑素的生成。其表面的蛋白酶活化受体(PAR-2)等参与黑素由黑素细胞进入角质形成细胞的过程。
关键词：角质形成细胞；黑素细胞PAR-2
The Role Of Keratinocyte In Hypermelanosis
Abstract: Hypermelanosis is a common cutaneous disease.The epidermal–melanin unit is composed of one melanocyte and approximately 36 neighboring keratinocytes, working in synchrony to produce and distribute melanin. Keratinocytes affect
melanocyte proliferation, dendricity, and melanin synthesis by producing soluble factors as well as keratinocyte–melanocyte contact.Modulation of PAR-2 activity can enhance or decrease melanosome transfer and affects pigmentation. Key words: Keratinocyte; Melanocyte; PAR-2
色素增加性皮肤病是一类临床上比较常见的显著影响美容的疾病。色素可以
*本文发表于中国美容医学，2007,16(5):703-705
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分成两大类：一类是内在色素，如黑色素、胆色素等；另一类是外在色素，如食 物中的胡萝卜素、药物和重金属。其中尤以黑素细胞合成的黑素过多或分布不均匀而导致的各类色斑最为常见，并且随着人们生活水平的提高而受到越来越广泛的关注。
表皮黑素单位为一多细胞结构功能单位。它由1个黑素细胞和大约36个相邻的角质形成细胞组成，它们共同完成黑素体的合成，转输和降解。黑素生成的过程已基本明确，对黑素细胞产生黑素的调控也已进行了深入的研究。然而在此过程中角质形成细胞(KC)与黑素细胞(MC)的相互作用以及黑素小体进入角质形成细胞的实际转运情况并没有完全清楚。本文将着重从角质形成细胞的角度阐述其在黑素形成过程中对黑素细胞的作用，以及在黑素转运过程中的，其表面的蛋白酶活化受体(PAR-2)参与黑素由黑素细胞进入角质形成细胞的过程。 一． 角质形成细胞的旁分泌作用
近年来研究发现，KC可通过分泌多种细胞因子及与MC的接触而对MC的生物学性状产生显著的影响。检测角质形成细胞分泌的作用于黑素细胞的因子主要有三个步骤：(1).将待测因子加入共培养物中检测其对黑素细胞的作用活性。(2).将待测因子的抗体加入共培养物中检测其是否能拮抗该因子对黑素细胞的作用。(3).应用ELISA和RIA方法检测培养的角质形成细胞周围该待测因子的浓度[1]。 此类细胞生长因子包括：α-促黑素细胞生长激素(α-MSH)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，干细胞因子(SCF)，内皮素 (ET-1，ET-2，ET-3)，前列腺素F2(PGF2)，神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)等[2
～5]
。
1. 促黑素细胞激素(促黑素、α-MSH)：来源于其前体激素阿黑皮素原(POMC)。KC是合成α-MSH的主要来源细胞。α-MSH通过和MC表面黑皮素受体(MCR)结合等途径，不仅可以促进MC的黑素合成，同时对维持和调节MC的树突形成、增殖功能起着重要的调节作用。α-MSH和黑皮素受体-1(MC1R)结合后通过激活腺苷酸环化酶提高细胞内环磷酸腺苷水平及酪氨酸酶的合成及表达，促使黑素合成。
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另外Park等认为α-MSH和MC1R结合后同时通过激活蛋白脂酶C途径，介导黑素合成的信号传导过程。α-MSH促进MC树突形成的机制尚不清楚，可能受MC1R介导的胞内多种信号途径的调控。体外培养的MC往往体积变小，树突数目减少。呈二极或三极形态。在含α-MSH的培养条件下，形成树突的数目增加，形态亦更接近于体内状态。天然促分裂剂ET-1可加强α-MSH的这一作用。
2. 内皮素（ET-1）：ET-1是从内皮细胞中分离出来的一种21肽血管收缩肽，人类黑素细胞具有高亲和性的ET-1受体，ET-1具有促进人类黑素细胞增殖和提高酪氨酸酶活性的功能。Joseph等发现角质形成细胞能合成和分泌ET-1。紫外线照射能促进培养的角质形成细胞分泌ET-1。因此可以推测ET-1可能是体内调节黑素细胞增殖及黑素合成的一个细胞因子。Hara等发现ET-1可促进培养黑素细胞树突数量增加，延长树突长度，呈剂量依赖性。ET-I还可通过Caspase-8的凋亡非依赖活性下调黑素细胞E-钙粘蛋白的表达[6]。
3. 神经肽：神经肽是具有促进神经系统中神经存活、生长的蛋白，其原型是 神经细胞生长因子(NGF)，另外还有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。近年来发现经紫外线照射后MC的NGF受体mRNA及蛋白的表达均明显增加，紫外线照射也可上调KC表达NGF。通过上调抗凋亡基因Bcl-2，NGF能够防止紫外线引起的MC死亡。bFGF 是从人黑素细胞瘤和胎牛垂体中提取的一种黑素细胞分裂剂，能代替TPA促进纯培养的黑素细胞的附壁、生长及分裂增殖。bFGF是最早确定的Mc生长因子之一，角质形成细胞能够合成和分泌bFGF，经UV照射后其表面bFCF表达明显上调。bFGF可能与ET-1在紫外线照射后共同促进MC的增殖及色素的增加。bFGF的促黑素细胞分裂作用需要cAMP的参与。
4. IFN-γ：在黑素细胞分化中有重要作用。正常的未激活的黑素细胞不表达MHCⅡ型抗原，IFN-γ能诱导黑素细胞表达MHCⅡ型抗原。MHCⅡ型抗原通常表达在发育异常的痣细胞和黑素瘤细胞上，被认为是恶变发生过程中的标志。IFN-γ能明显地改变正常人类黑素细胞的形态，诱导黑素细胞浆扩展变平，形似培养中的
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黑素瘤细胞。IFN-γ也诱导黑素细胞表达GD3 。这些作用可能与体内痣和黑素瘤的发生、发展有重要关系。
5. 一氧化氮(NO)：通过KC和MC共同培养发现，UV照射导致KC产生的NO具有促黑素生成的作用，同时这种作用可被NO清除剂阻断。研究发现NO引起的黑素生成的增加与MC内酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1的数量增加有关。
二．细胞—细胞连接
角质形成细胞具有强烈和独特的促进黑素细胞生长的作用 :黑素细胞的生长并非自主性，需要与 KC紧密连接来调节以保持生理性的黑素细胞和角质形成细胞比例。角质形成细胞具有表皮中黑素细胞适当的生理定位及分化所需的全部信息。角质形成细胞通过直接的细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态、树突形成和抗原表达。角质形成细胞能通过收缩和牵拉使新的树突从黑素细胞被动地拉出，力学的作用对于黑素细胞树突形成很重要。 粘附分子：钙粘蛋白和外源凝集素。
黑素细胞和角质形成细胞间的连接包括神经元间（神经突触），免疫细胞间（免疫突触），以及吞噬细胞与其靶细胞间（吞噬突触）的一系列特殊的连接，这些连接因此可以统称为色素突触。这些突触的建立包括细胞表面连接受体的聚集，从而引起肌动蛋白细胞骨架结构的改变，最终形成成熟稳定的连接结构。钙粘蛋白在黑素细胞和角质形成细胞间连接的建立中起了非常重要的作用。钙粘蛋
2+
白是一个糖蛋白家族，作为细胞连接中的跨膜物质对Ca依赖的细胞间粘连起到促
进作用[7,8]。E-钙粘蛋白和P-钙粘蛋白都表达在人黑素细胞表面，介导了黑素细胞与角质形成细胞的粘连。其中E-钙粘蛋白的作用更主要。Darier’s病的病人皮肤出现点状白斑使人们开始关注E-钙粘蛋白在色素转运中的作用，这一作用目前还需要进一步的研究。根据目前的数据提示，对于色素突触的推论研究将集中于位于粘附和分泌最前端的黑素细胞的树突部分。
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对吞噬突触的研究发现，色素突触中有凝集素参与作用[9]。凝集素是一种细胞表面粘附受体，可以结合胞膜边缘的糖原残基。流式细胞仪和电镜观测发现，在角质形成细胞－黑素细胞共培养物中加入凝集素及拟糖蛋白，可以抑制黑素的转运。这种抑制是可逆的，向共培养物中加入烟酰胺可使黑素转运加强。那些结合半乳糖残基的凝集素比结合甘露糖残基的凝集素更具活性。Cerdan等对这些分子在黑素细胞分泌的黑素小体结合角质形成细胞过程中的作用进行了研究。这一结合过程可以被拟糖蛋白抑制，提示角质形成细胞表面α-L-岩藻糖特异的凝集素和黑素小体表面6-磷-β-D-半乳糖特异的凝集素分别发挥作用。总之，凝集素和膜糖蛋白在黑素细胞和角质形成细胞的相互识别中起到了重要作用，它们可以促进黑素转运[10]。
1988年，Halaban[11]首次进行了MC和KC在MCDB－153、DMEM 和TIP三种培养基中的共培养，发现MC与 KC 能在MCDB-153培养基中存活超过14天，MC的树突延伸至相邻的KC；而MC 单培养于MCDB－153 时不能贴壁，7天后失去活性。Valyi—Nagy等将MC和KC 培养于三种不同的情况下：① MC和KC用微孔多聚碳酸酯膜隔开；② 单层细胞直接接触；③三维表皮重建。结果，在第一种情况下，MC的树突保持双级和三级，在 KC培养基中不能增殖；当MC和未分化的KC建立细胞间连接后，MC和KC以相似的速度分裂增殖，并发展为多级的树突状；在允许KC多层生长情况下共培养时，MC主要位于基底层未分化的KC间，有树突，并能输送黑素体给周围的KC，偶见小的MC集落散布在由已分化的KC组成的中层和上层，未见此类MC有树突生长和黑素体的输送。
另外，当黑素细胞和未分化的角质形成细胞直接连接时，黑素细胞表面黑素瘤相关抗原的表达降低到和正常皮肤相似的水平。据此，VaIyl—Nagv等提出了未分化的角质形成细胞通过直接的细胞一细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态和抗原表达的假说。这些结果提示皮肤痣细胞和黑素瘤细胞的表型特征即增殖和肿瘤相关抗原的表达可能是由于它们失去了与未分化的角质形成细胞的联系所致。
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三.角质形成细胞和黑素小体转运
早期的光学和电子显微镜研究提示，在黑素小体的转运过程中可能的转运机制至少包括：黑素小体释放进入细胞间隙继而被角质形成细胞内吞、直接注入、角质形成细胞与黑素细胞胞膜的融合及吞噬作用。
PAR-2与黑素小体转运:PAR-2是7个跨膜G蛋白连接的受体,在调节黑素小体转运中具有重要的作用。角质形成细胞表达PAR-2，但黑素细胞不表达。Seiberg M等发现含黑素细胞的表皮类似物变黑是对PAR-2激活的反应，类似于其对UVB照射的反应。胰蛋白酶抑制剂，如大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)可抑制PAR-2的裂解，能完全抑制UVB照射导致表皮合成物的色素沉着。黑素细胞与角质形成细胞一起单层培养，但不相互接触，对培养物PAR-2的调节没有作用。当两层和三层的角质形成细胞与黑素细胞在PAR-2特异性激活肽SLIGRL或STI的作用下共同培养时，才出现增加或减少色素沉着。这说明角质形成细胞与黑素细胞接触对PAR-2介导的色素沉着的作用是必需的。
角质形成细胞与黑素或分离的黑素小体孵育时，PAR-2的激活可增加角质形成细胞对黑素小体的摄取。通过STI抑制PAR-2的激活可导致相反的作用，表明PAR-2可能通过表皮角质形成细胞影响黑素小体的摄取[12]。PAR-2还具有介导吞噬的作用。Sharlow E等通过用荧光标记的生物素化的大肠杆菌K-l2颗粒和荧光微粒证实PAR-2在角质形成细胞吞噬中的调节作用[13]。在细胞骨架蛋白水平保持不变时，PAR-2的激活可增加肌动蛋白从核心区附近到质膜的聚合，而STI作用相反[14]。电子显微镜的研究表明，与未处理的对照组相比，SLIGRL处理的角质形成细胞，其伪足明显变长变细，数量增加，而用STI处理的细胞，细胞突触长度变短，数量减少。在培养条件下，角质形成细胞间的伪足连接明显受到PAR-2的影响[13,14],这表明PAR-2影响角质形成细胞的表面变化，激活角质形成细胞的吞噬。
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展望
色素增加性疾病是直接关系到人们生活质量的皮肤美容性疾病，随着人们生活水平的提高，受到越来越广泛的关注。临床目前主要用各类药物和激光进行对症治疗，疗效不确定。对黑素细胞和角质形成细胞相互作用及黑素体生成、转移、分布中的细胞和分子机制的更深入理解将对皮肤色素性疾病的实验研究和临床治疗产生
深远影响。角质形成细胞产生的可溶性因子影响黑素细胞的增殖及树突和黑素形成，将来的研究可能集中在角质形成细胞与黑素细胞相互作用的关键分子的识别、使角质形成细胞具有吞噬作用的“粘附”分子及其调控和PAR -2在角质形成细胞内的表达和信号的调控。
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致 谢
冬去春来，光阴荏苒，攻读硕士学位的三年时光转瞬即逝，从一个懵懂的本科学子到初涉科研领域的硕士研究生，时间赋予了我人生宝贵的一笔财富，直到今日执笔为硕士论文作跋，回首来路，有汗水，喜悦，也有羁绊，那些在求学跋涉的岁月中陪伴在身边的情谊，是珍藏在心中最动容的记忆，在此真诚地向所有关心帮助过我的人们致以最真挚的感谢！
值此论文付梓之际，我谨对尊敬的导师刘健航教授表示最深的谢意！古谚：一日为师，终身为父。于父母而言，一个谢字何其轻微，字词的苍白不足以表达心中最深刻的感动，只能说能成为您的学生，有机会跟随您涉足医学科学的殿堂，是我今生无尚的幸运与光荣。严谨的治学态度、忘我的敬业精神、对事业的执著追求，言传身教，耳濡目染，受益终身。无论是最深奥的学着做学问还是最平实的学习做人，您都是我心中最好的楷模。更难忘您平易近人的作风，亲切而真诚的关怀，您的关心爱护，于我，是涉世最初的凛冽中最温暖的感动，刻骨铭心。学生愚钝，不足雕琢，但蒙恩师三年教诲，此情深厚，铭记在心。
感谢导师组陈向东教授这三年来的全面指导，在实验和临床研究工作中都给予莫大的支持和帮助，在论文写作，课题设计和实施过程中提出了许多宝贵意见和建议，您的关心和教导是课题得以顺利完成不可或缺的重要支持。感谢徐慧老师，对我实验的指导和帮助，在课题的进行的每一个细节中，当我遇到困难，停滞不前时，总是帮我耐心地分析问题，解决困难，克服一个又一个难关。感谢汪蓓青老师，钱辉老师，沈征宇老师，张振老师在临床上的悉心指导，使我在过去的三年中受益非浅。感谢上海奥利实业有限公司江志洁总工程师对全部实验给予的帮助。
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感谢上海整复外科组织工程重点实验室的刘伟老师，周广东老师、张文杰老师、吴娟娟老师、刘德莉老师、殷德明老师在科研工作中的言传身教，对课题提出宝贵意见。
感谢九院科研处冯漪老师、丁燕君老师、戚燕老师，研究生处方燕、夏广忠等老师在工作和生活中给予的帮助。感谢所有帮助过我的老师和同仁。
感谢相伴一路走来的同窗申洁，费烨，陈军，难忘这段我们共同渡过的青春岁月。
在攻读学位的三年中，有幸结识了一批有才华，有抱负的同学。大家工作中互相学习和鼓励，学术上积极探讨，生活中互相帮助：感谢陈凡凡师姐手把手的实践指导、带我进入细胞实验这个陌生的领域。感谢罗旭松、王斌、蒋朝华各位学长一直以来在我人生道路上兄长般的照顾与帮助，与你们相识，乃人生幸事。感谢芮云峰、马刚、吴巍、金羽青、宋楠、赵远党、沈海燕、王海鹏、晏焕青、张阿莲等在各个方面给予我关心与支持的朋友们，三年的研究生时光，我们在磨练中一起成长，构成彼此人生长卷中明亮的一页，书写着关于友谊的瑰丽记忆。
最后，我要特别感谢我的家人：最亲爱的外公和父母，从孩提启蒙开始，在我漫长的求学生涯中，无论跌宕抑或起伏，一直陪伴在我身边，倾注了你们全部的岁月和心情，无怨无悔，用家的温暖构筑我前行最坚强的后盾，用爱和鼓励，给我直面人生一次次挑战的勇气。硕士学位里凝结着你们的心血和汗水，在此，深深地感谢你们为了我的学业和成长付出的所有！
百川到海，人生之路修远，惟努力向前，以飨岁月馈赠。
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发 表 文 章
1. 论著 新型内皮素拮抗剂对鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究. 中华皮肤科杂志.（修回）（第一作者）
2. 综述 角质形成细胞在色素增加性疾病中的作用研究进展. 中国美容医学. 2007，16卷，5期（第一作者）
3. 论著 熊果苷和甘草黄酮对B16细胞黑素合成的影响. 组织工程与重建外科杂志. 2008，4卷，3期（第一作者）
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三种美白剂对B16细胞黑素合成影响的研究
作者：
学位授予单位：
吴品茹
上海交通大学
相似文献(10条)
1.会议论文 樊邦棣.刘建贞 熊果苷的生产开发及其应用前景 1998
本文对熊果苷在化妆品种的应用进行了研究。文章围绕熊果苷美白剂用于化妆品美白活性与脱色机理、熊果苷与其他美白剂的比较、熊果苷的衍生物、熊果苷的制造、熊果苷的质量检测等进行了论述。
2.期刊论文 李玲.宋伟民.周华.LI Ling.SONG Wei-min.ZHOU Hua 4种美白剂对B-16细胞内酪氨酸酶活性抑制的研究 -宁夏医学院学报2006,28(1)
目的探讨4种常用皮肤美白剂(熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯)对皮肤黑素细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用.方法选用B-16小鼠黑素瘤细胞株,分别加入不同剂量美白剂(BL-99和曲酸衍生物的实验终浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL;熊果苷为10、30、50、70、100 μg/mL;氢醌酯为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL)3d后,采用台盼蓝排斥法计数活细胞数,参照Hideya Ando等的方法测定酪氨酸酶活性,探讨美白剂对培养细胞内酪氨酸酶活性的影响.结果 4种美白剂均可抑制B-16细胞生长,以氢醌酯对细胞生长数量的作用最大,熊果苷对细胞生长的抑制作用最弱.熊果苷对酪氨酸酶活性具有抑制作用;氢醌酯虽可导致B-16细胞的酪氨酸酶活性呈下降趋势,但与对照组相比,差异无统计学意义
(P＞0.05);曲酸衍生物和BL-99均可致B16细胞中酪氨酸酶活性呈波动性变化.结论 4种皮肤美白剂中除了熊果苷对酪氨酸酶的活性具有抑制作用外,其它3种美白剂均对酪氨酸酶抑制不明显,提示美白剂的美白机制是多方面的,可能不仅仅与酪氨酸酶的活性有关.
3.学位论文 李玲 美白化妆品功效评价的研究 2003
我们采用培养的B-16黑素瘤细胞,研究UVA对细胞黑素合成功能的影响,对几种常用美白剂进行了黑素细胞毒性和黑素合成的功效测试,并初步探讨美白化妆品的美白功效评价,以期为今后美白化妆品的功效评价和卫生监督提供测试指标和评价依据.研究表明:B-16黑素瘤细胞经UVA照射后,黑素含量增加,酪氨酸酶活性提高.UVA促细胞增殖作用的照射剂量在1.8J/cm<'2>以内,当照射剂量在3.6J/cm<'2>以上,细胞增殖率无明显变化.选用熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯等化学物进行细胞毒性试验.主要实验方法包括MTT实验和LDH释放试验.结果显示,这些化合物均可明显损伤B-16细胞.在实验使用时建议熊果苷以低于70μg/ml、曲酸衍生物以低于50μg/ml、BL-99以低于10μg/ml剂量为宜;并在美白化妆品和临床用药中应不使用或严格限量使用氢醌.几种美白剂均可抑制B-16细胞的黑素合成.熊果苷对酪氨酸酶有抑制作用,但曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯对酪氨酸酶活性抑制不明显.在皮肤美白功效评价中,应以黑素含量改变的结果为基准.
4.期刊论文 李玲.宋伟民.周华.LI Ling.SONG Wei-min.ZHOU Hua 4种美白剂对皮肤黑素细胞的细胞毒作用研究 -宁夏医学院学报2006,28(2)
目的探讨4种常用皮肤美白剂(熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯)对皮肤黑素细胞的细胞毒作用.方法选用B-16黑素瘤细胞株,分别加入不同剂量(BL-99和曲酸衍生物的实验终浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg/mL;熊果苷为10、30、50、70、100 μg/mL;氢醌酯为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL)美白剂3d后,采用台盼蓝排斥法计数活细胞数,采用丙酮酸比色法测定细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)释放水平.结果4种美白剂均可使培养细胞数量明显减少,细胞增殖抑制率明显上升.熊果苷、曲酸衍生物和BL-99等三种美白剂均可导致培养细胞释放LDH水平明显升高,氢醌酯在低浓度(0.1～0.5μg/mL)时引起B-16细胞LDH释放水平明显高于对照组,而浓度超过1 μg/mL时细胞LDH释放水平则呈下降趋势.结论4种皮肤美白剂均可抑制黑素细胞的生长,具有明显的细胞毒性.在实际使用时建议熊果苷以低于70μg/mL、曲酸衍生物以低于50μg/mL、BL-99以低于10μg/mL剂量为宜,并在美白化妆品和临床用药中不使用或严格限量使用氢醌酯.
5.期刊论文 李玲.宋伟民.周华.LI Ling.SONG Wei-min.ZHOU Hua 4种皮肤美白剂对小鼠黑素瘤细胞的功效评价 -环境与职业医学2006,23(5)
[目的]探讨4种常用皮肤美白剂的美白效果.[方法]选用B-16小鼠黑素瘤细胞,分别加入熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯等4种常用皮肤美白剂3 d后,用台盼蓝排斥法计数活细胞数,参照Hideya Ando等的方法测定酪氨酸酶活性和黑素含量.[结果]4种美白剂均可明显抑制B-16小鼠黑素瘤细胞生长和黑素合成,改变细胞形态.氢醌酯对细胞生长数量的控制作用最大,熊果苷最弱.熊果苷对酪氨酸酶活性具有抑制作用;氢醌酯虽可导致B-16细胞的酪氨酸酶活性呈下降趋势,但与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);曲酸衍生物和BL-99均可致B-16细胞中酪氨酸酶活性呈波动性变化.[结论]4种皮肤美白剂均可抑制黑素细胞的生长和黑素合成,具有一定的美白效果,其机制可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关.
6.学位论文 闫静 高活性的酪氨酸酶抑制剂α-熊果苷的合成及工艺优化 2006
自然界中存在众多具有特定生理活性的小分子酚性糖苷化合物，熊果苷就是其中一种，它能抑制皮肤合成黑色素的关键酶——酪氨酸酶的活性，近年来被广泛应用为美白剂。α-熊果苷，即4-羟基苯基-1'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷，是熊果苷的的端基异构体，它对酪氨酸酶活性的抑制作用比天然熊果苷更强，安全性更好，因而被认为是目前最安全高效的美白剂。
α-熊果苷化学合成方法很少，而且选择性或产率都很低，尚未实现工业化。论文以课题组合成α-熊果苷的成果为研究基础，进一步探索原料易于制备、产物立体选择性好、收率远高于现有技术、环境友好、具有工业可行性的化学合成方法。综合比较实验结果，确定α-熊果苷的最佳合成路线：以1-甲氧基-α-D-吡喃糖苷为反应起始物，经四步反应，得到终产物α-熊果苷。缩短了糖给体制备步骤，避免了使用过多昂贵、有毒的化学试剂；总收率为27﹪，比已有研究成果的总收率提高了近一倍，具有较大的实际应用价值。
7.期刊论文 周林平 新型含糖苷的吡唑类美白剂的合成与性能研究 -化学工程与装备2010,\"\"(3)
近年来,熊果苷作为一种天然美白添加剂广泛应用于化妆品中.但是,它在美白效果、稳定性等方面还存在着或多或少的不足.本文中,笔者经过反复实验,用葡萄糖和甲氧基苯为原料,合成了一种新型熊果苷类似物,其在抑制黑色素细胞增殖的过程中,表现出了比熊果苷更强的性能.从而,为新型美白添加剂的研究开发,提供了新的思路和方向.
8.学位论文 袁玉梅 高性价比美白护肤品的研制 2008
本文针对目前普遍使用美白活性成分存在诸如稳定性、吸收性、有效性、安全性等各种不是很理想的现状，从美白机理、皮肤科学角度，对护肤品用美白体系进行优化，研制具高性价比的美白护肤品，主要工作内容如下:
根据皮肤美白的三个时期-美白前期护理、激活期、保护期，收集、整理各种美白剂，初步筛选出性价比较高的美白活性成分。
通过酪氨酸酶活性试验，筛选出Phytolight、α-熊果苷、VCE、MelarrestL对酪氨酸酶活性抑制率较高。
把对酪氨酸酶活性抑制率较高的美白活性成分配制成护肤用膏霜，并考察其稳定性，除β-熊果苷、AA2G、Vc-IP易变色外，其它稳定性均合格。
采用Mexameter MX18红斑黑素测量仪对相关样品进行人群试用评估，结果显示:样品1，其美白剂组合为2.0%Phytolight+0.5%MelarrestL，第60天有显著性差异(P<0.05)；样品2，其美白剂组合为1%L-乳酸+1.0%α-熊果昔+0.5%MelarrestL，第30天有显著性差异(P<0.05)；样品3，其美白剂组合为1%L-乳酸+1.0%VCE+0.5%MelarrestL，第45天有显著性差异(P=0.05)；样品1、样品2、样品3与空白相比第45天无显著性，但第60天有显著性。其中样品2美白组合性能最佳。
进行人群评估的3个样品，经斑贴试验安全性评估，均无刺激性。优选样品进行细胞毒性试验，与空白对照细胞形态的无明显变化，细胞毒性很低。综上，本研究优选出高性价比的美白护肤品为样品2，其美白活性成分组合为1%L-乳酸+0.5%α-熊果苷+0.5%MelarrestL。
9.期刊论文 陆晔.朱佩云.项翠琴 三种美白剂对皮肤黑素细胞内酪氨酸酶活性抑制的探讨 -上海预防医学2003,15(4)
[目的]探讨3种常用美白剂(对苯二酚、熊果苷、曲酸)对皮肤黑素细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用.[方法]利用B-16黑素瘤细胞株,分别加入美白剂5 d后,采用丙酮酸比色法测定细胞培养上清液胞浆酶(乳酸脱氢酶,LDH)释放水平,探讨美白剂的细胞毒性.采用冻融法提取培养细胞内酶液后,用L-酪氨酸作底物,测定美白剂对培养细胞内酪氨酸酶活性的影响.[结果]加入不同剂量(8、16、24、32、40、48μg/mL)美白剂后,对苯二酚对细胞有明显的毒性,影响细胞的生长.熊果苷、曲酸对培养细胞无明显的毒性,但对细胞内酪氨酸酶活性有明显的抑制作用. [结论]3种美白剂均能不同程度地抑制皮肤黑素细胞内酪氨酸酶活性,达到美白作用.
10.会议论文 康琰琰.张美英.邢少.熊盛.王一飞.朱艳梅 海藻多糖对酪氨酸酶活性和黑素合成的抑制作用 2005
目的：研究海藻多糖对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞的酪氨酸活性和黑素合成的抑制作用,并以熊果苷作为阳性对照进行比较.方法：测定药物对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞的细胞活力,酪氨酸酶活性及黑素含量的影响,并与熊果苷的结果进行比较.结果：海藻多糖对黑素瘤细胞活力几乎无影响.对酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制,与之比较,熊果苷具有明显的细胞毒性.结论：海藻多糖对细胞的无毒性,及其抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素合成的作用使具有开发成为一种安全有效的美白药物及美容保健品的潜力.
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_D054353.aspx
授权使用：吕先竟(wfxhdx)，授权号：9f546ff3-61c8-42cf-8c4e-9e2200e89316
下载时间：2010年11月2日
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