(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111808177 A(43)申请公布日 2020.10.23
(21)申请号 202010749129.8(22)申请日 2020.07.30
(71)申请人 吉林中粮生化有限公司
地址 130000 吉林省长春市经济技术开发
区仙台大街1717号
申请人 江南大学(72)发明人 佟毅 刘松 徐奎栋 李江华
陈坚 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 仇钰莹(51)Int.Cl.
C07K 14/32(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12N 15/75(2006.01)
(54)发明名称
提高蛋白表达量的信号肽及其应用(57)摘要
本发明公开了提高蛋白表达量的信号肽及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达宿主，将枯草芽孢杆菌内源信号肽Bp、NprB、YdjM分别融合至普鲁兰酶基因的N端，并将这3种信号肽进行同义突变，经发酵后选择最有利于普鲁兰酶表达的同义突变核苷酸序列，所得到的突变后的3种信号肽序列，可使普鲁兰酶胞外酶活分别提高至改造前的4.15，2.33，1.67倍，有利于提高普鲁兰酶的胞外表达，有利于规模化生产普鲁兰酶。
C12N 9/44(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C07K 14/435(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/125(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页序列表8页 附图2页
CN 111808177 ACN 111808177 A
权 利 要 求 书
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1.信号肽，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任一所示。2.一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，其特征在于，向编码蛋白的核苷酸序列的N端添加权利要求1所述信号肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在蛋白的N端添加权利要求1所述信号肽，获得编码重组蛋白的基因；(2)构建表达步骤(1)所述基因的重组质粒，再将构建的重组质粒导入枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括普鲁兰酶和/或sfGFP。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶的NCBI登录号为AMQ67157。6.一种重组质粒，其特征在于，连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的信号肽。
7.一种提高蛋白表达量的方法，其特征在于，利用含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一的信号肽的基因工程菌发酵生产蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述重组菌以1～10mL/100mL的接种量接种至培养体系中，所述基因工程菌接种时的OD600不低于3.0。
9.一种宿主细胞，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一的信号肽，或含有权利要求6所述重组质粒。
10.权利要求1所述信号肽，或权利要求2～5或权利要求7或8任一所述方法，或权利要求6所述重组质粒，或权利要求9所述宿主细胞在提高胞外蛋白表达量中的应用。
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说 明 书
提高蛋白表达量的信号肽及其应用
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技术领域
[0001]本发明涉及提高蛋白表达量的信号肽及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。
背景技术
[0002]普鲁兰酶能够专一性水解支链淀粉的分支，在淀粉糖化工艺中，常与葡糖淀粉酶或β-淀粉酶联用，生产葡萄糖浆和麦芽糖浆。因此在多种工业领域(如食品、药物中间体及饲用酶制剂等)中，都得到了广泛的应用，是生产工艺中保障高效生产和经济效益的重要法宝。随着DNA重组技术的迅速发展，大量研究采用基因工程菌来表达普鲁兰酶，以期走出野生菌普鲁兰酶产量低下的困境。
[0003]枯草芽孢杆菌具有无致病性、且结构简单、有利于蛋白质的跨膜分泌过程等特点；此外，其还有无明显的密码子偏好性、具有很强的蛋白分泌能力；因而被广泛应用于基因工程技术中，用以表达蛋白。虽然前期也有通过改造普鲁兰酶本身的氨基酸组成、或利用一些信号肽诱导蛋白的表达，来提升普鲁兰酶胞外表达的活力；但是对酶本身的氨基酸组成发生改变常常会导致酶本身的催化性能受到影响，而利用信号肽虽然使得蛋白的表达量得到了提升，但普鲁兰酶的表达量依旧无法满足工业化大规模生产的需求。[0004]因而，需要寻找一种将普鲁兰酶胞外表达量得到进一步提升的同时，又不改变酶本身性能的方法，以适应普鲁兰酶规模化生产的需求。发明内容
[0005]为解决目前存在的问题，本发明通过对信号肽N端编码区(NCS)进行同义突变，在确保蛋白翻译不受影响的情况，筛选出能显著提高蛋白表达量的信号肽，为蛋白的高效表达提供了一种新方法。
[0006]本发明提供了一类信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一。
[0007]本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，在编码蛋白的核苷酸序列的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽。[0008]在本发明的一种实施方式中，在目的蛋白的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，并构建重组质粒，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌。[0009]在本发明的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽添加至编码目的蛋白的核苷酸序列的起始密码子ATG后。[0010]在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为普鲁兰酶和/或sfGFP。[0011]在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶氨基酸序列的NCBI登录号为AMQ67157，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。[0012]在本发明的一种实施方式中，编码所述sfGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。[0013]本发明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽的重组质粒。
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说 明 书
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在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒上含有组成型或诱导型启动子。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述组成型或诱导型启动子为能够在枯草芽孢杆菌中表达的启动子。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述启动子包括LytR启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以任意能在枯草芽孢杆菌中表达的表达质粒为出发载体。
[0018]在本发明的一种实施方式中，所述出发载体包括P43NMK。[0019]本发明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，或含有所述重组质粒的宿主细胞。
[0020]在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主。[0021]在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600和/或枯草芽孢杆菌168。
[0022]本发明提供一种提高蛋白表达量的方法，利用所述含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的重组菌发酵生产蛋白。[0023]在本发明的一种实施方式中，将所述重组菌在种子培养基中培养至为OD600不低于3.0的菌液，再将该菌液以1～10mL/100mL的接种量接种至反应体系中。[0024]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的组分包括蛋白胨5～20g/L，酵母提取物20～30g/L，甘油1～5mL/L，KH2PO4 0.01～0.02mol/L，K2HPO4 0.6～0.8mol/L。[0025]在本发明的一种实施方式中，在30～40℃、200～250rpm发酵20～40小时。[0026]本发明还保护所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，或所述含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的重组质粒在提高胞外蛋白表达量中的应用。[0027]本发明还保护所述含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽的宿主细胞在提高胞外蛋白表达量中的应用。
[0028]本发明还保护提高蛋白表达量的方法，或提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法在提高胞外蛋白表达量中的应用。[0029]本发明的有益效果：
[0030]本发明通过同义突变信号肽所得的核苷酸序列，融合在普鲁兰酶的N端，普鲁兰酶的胞外酶活分别提高4.15，1.67，2.33倍。附图说明
[0031]图1为信号肽Bpr和sfGFP分别融合在普鲁兰酶N端和C端的表达质粒图谱。[0032]图2为信号肽Bpr融合在普鲁兰酶N端的表达质粒图谱。[0033]图3为野生型与NCS改造菌株分泌的普鲁兰酶胞外酶活。
具体实施方式[0034]1、培养基
[0035]LB种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。[0036]TB发酵培养基(g/L)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘
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说 明 书
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油4mL；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH2PO4、0.72mol/L的K2HPO4溶液(2.31g的K2HPO4和12.54g的K2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL；0.22μm的滤膜过滤除菌)。[0037]2、培养方法[0038]种子培养：挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h。[0039]发酵培养：按4mL/100mL的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，发酵48h。[0040]3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定[0041]在96孔板中假如200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm，绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。[0042]4、普鲁兰酶酶活测定方法[0043]将1mL 1mg/100mL的普鲁兰多糖底物和0.9mL 100mM pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mL DNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。[0044]5、使用的试剂
[0045]一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。[0046]实施例1：构建Bpr信号肽NCS同义突变文库[0047]将LytR启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)通过连接至P43NMK质粒，构建得到重组质粒，将重组质粒转入E.coli JM109中，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆测序验证，得到质粒P43NMK-LytR；利用相同的一步克隆方法，将普鲁兰酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)融合至LytR的下游，构建得到重组质粒P43NMK-LytR-Pul；利用相同的一步克隆方法，分别将sfGFP荧光蛋白和Bpr信号肽(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)分别连接至普鲁兰酶的C端和N端，构建得到重组质粒P43NMK-Bpr-Pul。[0048]以P43NMK-Bpr-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示)，通过PCR获得Bpr的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变。[0049]实施例2：构建YdjM信号肽NCS同义突变文库[0050]具体实施方式同实施例1，区别在于，在得到P43NMK-LytR-Pul后，利用一步克隆法，分别将sfGFP荧光蛋白和YdjM信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)分别连接至普鲁兰酶的C端(sfGFP荧光蛋白)和N端(YdjM信号肽)，构建得到重组质粒P43NMK-YdjM-Pul。[0051]以P43NMK-YdjM-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13所示)，PCR获得YdjM的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变。[0052]实施例3：构建NprB信号肽NCS同义突变文库[0053]具体实施方式同实施例1，区别在于，在得到P43NMK-LytR-Pul后，利用一步克隆
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法，分别将sfGFP荧光蛋白和NprB信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)分别连接至普鲁兰酶的C端和N端，构建得到重组质粒P43NMK-NprB-Pul。[0054]以P43NMK-NprB-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14所示)，PCR获得Epr的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变[0055]实施例4：信号肽NCS同义突变文库最优序列的筛选
[0056]将实施例1～3中构建得到的同义突变重组质粒分别转化至表达宿主枯草芽孢杆菌WB600中，将转化液涂布于含有50μg/mL卡纳霉素抗性的LB平板，在37℃下培养至长出单克隆，挑取单克隆至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的200μL LB培养基的96浅孔板，培养种子液8小时；
[0057]接着，按照4mL/100mL的接种量接种至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的800μL TB培养基的96深孔板，培养24小时；
[0058]然后将发酵液迅速置于冰上冷冻，离心后，去除上清，将100mM、pH 7.2的PBS缓冲液稀释至一定倍数后，通过酶标仪测定荧光值(激发光480，吸收光520)以及OD600。[0059]相对荧光强度RFI＝荧光值/OD，选择相对荧光强度最高的细胞送至上海生工公司测序，改变体认为是最有利于促进普鲁兰酶表达的信号肽序列。[0060]经测序鉴定后，Bpr信号肽在N端成功实现同义突变，其同义突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；YdjM信号肽在N端成功实现同义突变，其同义突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；NprB信号肽在N端成功实现同义突变，其同义突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
[0061]实施例5：同义突变信号肽在生产普鲁兰酶中的应用
[0062]将实施例4中测序得到的含有3种信号肽同义突变序列的重组菌提取重组质粒，使用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.15和16所示)，去除重组质粒上的sfGFP荧光蛋白，并将去除了sfGFP荧光蛋白的重组质粒质粒转化到枯草芽孢杆菌WB 600中，测序验证正确的即为含有信号肽同义突变序列的阳性转化子，将阳性转化子接种至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm培养8小时后，使得菌液OD600达到4以上，按照4mL/100mL的比例将菌液接种到含有50μg/mL卡纳霉素抗性的25mL TB培养基的250mL摇瓶中，在37℃、250rpm发酵30小时后，测定普鲁兰酶的胞外酶活，结果如图3和表1所示。[0063]通过测定普鲁兰酶的胞外酶活，发现Bpr、YdjM、NprB信号肽的同义突变序列分别能使胞外酶活较野生型提高4.15、1.67、2.33倍。[0064]表1普鲁兰酶胞外酶活(U/mL)
[0065]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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SEQUENCE LISTING<110> 吉林中粮生化有限公司江南大学<120> 提高蛋白表达量的信号肽及其应用<160> 16<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 87<212> DNA<213> 人工序列<400> 1agaaaaaaaa caaaaaatag acttataagt tctgttttaa gtacagttgt catcagttca 60ctgctgtttc cgggagcagc cggggca 87<210> 2<211> 81<212> DNA<213> 人工序列<400> 2ttaaaaaaag taatattagc tgcttttata ttagtaggaa gtactttggg agcttttagt 60ttttcatcag atgccagtgc g 81<210> 3<211> 81<212> DNA<213> 人工序列<400> 3cgaaatttaa ctaaaacatc actattacta gccggcttat gcacagcggc ccaaatggtt 60tttgtaacac atgcctcagc t 81<210> 4<211> 320<212> DNA<213> 人工序列<400> 4ctaaccctac ataagtacct tcttttgttt caatgttact gtctggcgat acatcttcac 60cttgactctt ttgactatta accccgcaac ccgaaagaag caatataaag aacagtaaag 120caataaattt tttcattttt ttcacctcat tatattttat cgtcaaccta ttttatattt 180taaagaaaaa ttaagaaaca atgaaacttt tttttataaa aaacgactat tttaggattt 240cattcttgta ttaaatagag ttgtatttat tggaaattta actcataatg aaagtaattt 300aaaggaggtg aaatgtacac 320
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<210> 5<211> 724<212> PRT<213> 人工序列<400> 5Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn1 5 10 15Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala 20 25 30Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val 35 40 45Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly Gln Val Glu Ser Gly Val Lys 50 55 60Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His65 70 75 80Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro 85 90 95Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu 100 105 110Gly Asn Thr Tyr Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro 115 120 125Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser 130 135 140Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu145 150 155 160Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val 165 170 175Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala 180 185 190Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr 195 200 205Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile 210 215 220Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp225 230 235 240Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu 245 250 255Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu 260 265 270
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Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser 275 280 285Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp 290 295 300Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn305 310 315 320Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His 325 330 335Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe 340 345 350Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr 355 360 365Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn 370 375 380Glu Ile Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser385 390 395 400Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp 405 410 415Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu 420 425 430Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr 435 440 445Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala 450 455 460Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala465 470 475 480Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly 485 490 495Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile 500 505 510Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser 515 520 525His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn 530 535 540Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val545 550 555 560Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met 565 570 575Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala
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580 585 590Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe 595 600 605Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe 610 615 620Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn625 630 635 640Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys 645 650 655Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val 660 665 670Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser 675 680 685Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln 690 695 700Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp705 710 715 720His Gly Lys Lys<210> 6<211> 2172<212> DNA<213> 人工序列<400> 6gatgctgcta aaccagcagt ttctaacgct taccttgacg cttctaacca agttttagtt 60aaattatctc aaccattaac attaggtgaa ggtgcttctg gtttcactgt acatgatgac 120actgctaaca aagacatccc agtaacatct gtaaaagacg cttctttagg tcaagttgaa 180tcaggtgtaa aaactgacct tgttactgtt actttaggcg aagatccaga tgtatctcac 240actttatcta tccaaacaga cggttaccaa gctaaacaag taatcccacg taacgtactt 300aactcttctc aatattacta ttctggtgat gatttaggaa acacatacac acaaaaagct 360actactttca aagtttgggc tcctacatct actcaagtta acgtattgtt atacgattct 420gctacaggta gcgttacaaa aatcgttcca atgacggctt caggtcacgg tgtttgggag 480gctactgtta accaaaactt agaaaactgg tactacatgt acgaagtaac tggtcaaggt 540tctacacgca ctgctgttga tccttacgct actgctatcg ctccaaacgg tacacgcggc 600atgatcgtag atttagctaa aactgaccca gcaggttgga actctgataa acacattact 660ccaaaaaaca ttgaagatga agttatctac gaaatgcacg tacgtgattt ctctatcgat 720ccaaactcag gtatgaaaaa caaaggtaaa tacttagctc taactgaaaa aggcactaaa 780ggtcctgata acgttaaaac aggtatcgac tctcttaagc aattaggtat tacacatgtt 840caattaatgc cagttttcgc atctaactca gttgacgaaa ctgatccaac acaatacaac 900tggggttacg acccacgtaa ctacgatgta ccagaaggtc aatatgcaac taacgctaac 960
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ggtaacgcac gtattaaaga attcaaagaa atggttttat cactacaccg tgagcacatc 1020ggtgttaaca tggacgttgt ttacaaccac acgttcgcta ctcaaatctc tgacttcgat 1080aaaattgttc cagagtacta ttaccgcact gacgacgcag gtaactacac taacggttct 1140ggtactggta acgaaattgc tgcagaacgt cctatggtgc aaaaattcat catcgatagc 1200cttaaatact gggttaacga ataccacatt gacggcttcc gtttcgactt aatggcttta 1260cttggtaaag acacaatgtc taaggctgct tctgagttac atgctatcaa cccaggtatt 1320gctttatatg gcgaaccttg gactggtggt acaagcgctc ttcctgacga ccaactttta 1380actaaaggtg cacaaaaagg catgggagta gctgtattca acgataacct tcgtaacgca 1440ttagacggaa acgttttcga ttcttctgct caaggattcg caacaggagc tacaggtctg 1500actgatgcta ttaaaaacgg agttgaagga tcaatcaacg atttcacttc ttctcctggc 1560gaaacaatta actacgttac atcacacgat aactacactc tttgggacaa aatcgctttg 1620tctaacccta acgactctga agcagatcgc atcaaaatgg atgagcttgc tcaagctgtt 1680gttatgactt ctcaaggtgt acctttcatg caaggtggtg aagaaatgtt acgcactaaa 1740ggtggtaacg ataacagcta taacgcgggt gatgctgtaa acgaattcga ctggtctcgt 1800aaagctcaat accctgacgt tttcaactac tactcaggtt taatccacct tcgtcttgac 1860catccagctt tccgtatgac aacagctaac gaaatcaact ctcaccttca attccttaac 1920tcacctgaaa acacagtagc ttacgaactt actgaccacg taaacaaaga taaatggggt 1980aacattatcg ttgtttacaa ccctaacaag actgtagcaa ctatcaactt accatctggt 2040aaatgggcta tcaacgcaac tagcggtaaa gtaggtgaat ctacattagg tcaagctgaa 2100ggatctgtac aagttcctgg tatttctatg atgatccttc accaagaagt ttctccagat 2160cacggtaaaa aa 2172<210> 7<211> 717<212> DNA<213> 人工序列<400> 7gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgaga ggcgagggcg agggcgatgc caccaatggc 120aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcgc 240cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcagtttc 300aaggacgacg gcacatacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600ctgagcaccc agtccgtgct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaa 717<210> 8
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<211> 87<212> DNA<213> 人工序列<400> 8aggaaaaaaa cgaaaaacag actcatcagc tctgttttaa gtacagttgt catcagttca 60ctgctgtttc cgggagcagc cggggca 87<210> 9<211> 81<212> DNA<213> 人工序列<400> 9ttgaagaaag tcattttagc cgcttttatc ttagtaggaa gtactttggg agcttttagt 60ttttcatcag atgccagtgc g 81<210> 10<211> 81<212> DNA<213> 人工序列<400> 10cgcaacttga ccaagacatc tctattactg gccggcttat gcacagcggc ccaaatggtt 60tttgtaacac atgcctcagc t 81<210> 11<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<400> 11gtgtacattt cacctccttt aaattacttt cattat 36<210> 12<211> 61<212> DNA<213> 人工序列<220><221> misc_feature<222> (15)..(15)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (27)..(27)<223> n is a, c, g, or t<400> 12
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atgagraara aracnaaraa yagrctnath agytctgttt taagtacagt tgtcatcagt 60t 61<210> 13<211> 64<212> DNA<213> 人工序列<220><221> misc_feature<222> (15)..(15)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (24)..(24)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (27)..(27)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (30)..(30)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (33)..(33)<223> n is a, c, g, or t<400> 13atgaaraaya tgtcntgyaa rctngtngtn tcngtcactc tgtttttcag ttttctcacc 60atag 64<210> 14<211> 61<212> DNA<213> 人工序列<220><221> misc_feature<222> (6)..(6)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature
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<222> (12)..(12)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (21)..(21)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (27)..(27)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (30)..(30)<223> n is a, c, g, or t<220><221> misc_feature<222> (33)..(33)<223> n is a, c, g, or t<400> 14atgccntayc tnaarcgngt nttrctnctn ctngtcactg gattgtttat gagtttgttt 60g 61<210> 15<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<400> 15cggtaaaaaa taatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agat 44<210> 16<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<400> 16gataatctca ttatttttta ccgtgatctg gagaaacttc 40
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