目 录
提要 1
前言 2
第一部分 ｒｈＩＬ－１１在猕猴中的药代动力学研究 ５
第二部分 ｒｈＩＬ－１１在小鼠体内的分布和排泄 １８
讨论 35
参考文献 40
附录 43
致谢 50
摘要 i
Abstract iii
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
前 言
血小板减少症是急性白血病高剂量化疗后的主要伴发症。近年来，越来越多地使用输注血小板，虽然总的来讲这种方法对预防严重的出血有效，但具有传播血液疾病的危险并产生自身免疫反应。所以，临床上需要一种可靠的药物用于减轻白血病治疗后的血小板减少症。[1]
人IL-11cDNA编码199个aa，前体多肽由21个aa残基的疏水信号序列组成。人IL-11基因大小为7kb，含5个外显子和4个内含子，定位于染色体19q13.3-13.4，由于具有两个聚酰苷酸位点，IL-11基因表达1.5和2.5kb两种RNA转录形式。3?非编码区IL-11mRNA具有多个AUUUA重复，这可能对调整mRNA稳定性十分重要。IL-11多肽不含丝氨酸和潜在的糖基化位点。IL-11蛋白的三维结构几乎没有报道，通过计算机二级结构预测，基于分子的高度螺旋化，位于外显子和内含子的边界和限定的蛋白水解分析，可能存在4个螺旋束的结构基元。[2]
IL-11专一受体是一个多组分复合物。它含有IL-11专一?链和一个130kDa信号转导?亚单位（gp130），gp130还是其它IL-6型细胞因子如IL-6、白血病抑制因子（LIF）、制瘤素M和纤毛神经营养因子（CNTF）的共同受体。克隆了人IL-11受体?链，它位于第9号染色体上。[3,4]IL-11介导的信号转导机制尚未完全阐述清楚。目前的观点认为，IL-11结合导致gp130均二聚体形成，依次再活化几个潜在的信号转导通路。已表明与受体相关的两面神激酶（JAKs），有丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）和核糖体S6蛋白激酶有关。Src家族激酶，特别是P60src和P62res也与IL-11介导的转导通路有关，这些激酶通过磷脂酰肌醇-3?激酶发挥作用。[5]
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在体外，适当地刺激各种基质细胞（包括纤维母细胞，上皮细胞，软骨细胞，滑膜细胞，骨肉瘤细胞，成骨细胞和成纤维胶质细胞瘤细胞）都可检测到IL-11转录。诱导IL-11的刺激随组织的不同而不同，这些刺激包括TGF-?1-3，IL-1，TNF，甲状旁腺素，甲状旁腺素相关蛋白，钙离子载体，佛波酯以及各种病毒，如呼吸道合胞病毒（RSV），鼻病毒（RV）和副流感病毒3型（PIV3）。[6,7]组胺和噬酸性粒细胞主要基本蛋白（MBP）增加细胞因子诱导的IL-11产量，而肝素和干扰素?抑制IL-11产生。
小鼠静脉注射IL-11后，从循环中迅速消失。早期它主要分布于肾脏和肝脏。在尿中几乎没有检测到IL-11，暗示从肾小球滤过的IL-11通过肾小管有效重吸收。[8]介导IL-11降解的过程很难理解。
IL-11是一个多效性分子。它是造血的重要调节剂，可以刺激体内巨核细胞增加，刺激红细胞增加并能调节巨噬细胞增殖和分化。[9]它还能刺激各种浆细胞瘤细胞系增殖，刺激B细胞产生在免疫球蛋白，抑制脂肪细胞，调节神经元分化，刺激金属蛋白酶-1的组织抑制剂（TIMP-1）产生并能活化破骨细胞。[10]在体外，IL-11还是肝细胞产生各种抗蛋白酶和其他血清蛋白（称作急性期蛋白）的有效刺激剂。然而，人们对这种刺激的体内重要性产生质疑。[11]IL-11的迷人作用之一是它能够保护受到损伤的粘膜，在胃肠道尤为显著。IL-11保护放化疗后的小肠细胞，减轻实验性的粘膜炎，并改善炎性大肠病的损伤。[12]这些作用并不只局限于腹腔，因为还显示胸部经照射后IL-11可以其改善存活期细胞。[13]IL-11诱导的保护机制尚不清楚。然而，这可能与IL-11能够抑制巨噬细胞产生TNF、IL-12或/和NO，阻止上皮细胞凋亡[14]以及保护克隆源性干细胞有关。
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美国FDA于1997年批准Genetic Institute(GI)公司的rhIL-11，用于治疗血小板减少症、与癌症放化疗和骨髓移植相关疾病。虽然，rhIL-11在国外已批准上市，国内尚未批准上临床实验。生物技术药物尤其是基因重组蛋白多肽药物的医学应用是近年来国内外关注的新课题和动向，我国对生物高技术产品的医学应用极重视，许多已列入国家重点或重大项目。目前面临基础研究转向临床试验和市场应用的新阶段，急待解决动物和人体内药代动力学方法学和代谢特点问题，它对于安全有效评价药物和深刻认识药物作用机理有重要意义，也是申报新药必需的资料。国外生物技术药物总体研制水平高于我国，许多药代动力学资料多属于技术机密资料，需要我国独自创新解决技术上关键性难点。
本论文为中科院成都地奥制药公司产rhIL-11申报二类新药的临床前动物药代动力学研究实验。本实验用R&D Systems公司产ELISA药盒研究了成都地奥制药公司产重组人白细胞介素11(rhIL-11)在猕猴中的药代动力学。实验设置了多次连续给药的药代动力学研究，这是国内外尚未见进行的内容，因为动物药效学和拟推荐临床使用都是多次给药，所以有必要比较单次与多次药代动力学的异同。本实验研究和发现药物全身曝露量(systemic exposure intensity)与外周血血小板增高的关系，这对正确应用药物有指导意义，也未见国外研究报道。选择C57小鼠进行药物体内分布，排泄，血浆蛋白结合，和代谢降解研究与GI公司采用大鼠进行实验不同。采用125I-rhIL-11结合分子排阻高效液相(SHPLC)研究药物和血浆蛋白结合，药物代谢和降解的研究，这点在GI研究中没有进行是本实验首次进行的研究。它对于深入了解药物体内过程和发挥药物作用有重要指导意义。
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第一部分
重组人白细胞介素１１在猕猴中的药代动力学研究
１．试验目的和要求
本资料为成都地奥制药公司产rhIL-11申报二类新药的临床前动物药代动力学研究组成部分，观察了猕猴单次静脉(i.v.)或皮下(s.c.)注射不同剂量rhIL-11及连续皮下注射后血清药物浓度变化及动力学参数。
２．试验材料和方法
２．１ 受试品： 重组人白细胞介素-11(rhIL-11)成都地奥制药公司产，批号：981201，纯度 > 95 %，2 mg.mL-1，4 ℃保存，用前即刻生理盐水稀释。
２．２ 动物： 猕猴，军事医学科学院实验动物中心产(军医动字第BDW95002号)，共9只，雌3只，雄6只，体重4.0 ± 0.4 kg。分笼用动物中心生产猴标准饲料喂养，自由饮水，每日给新鲜水果两次。 ２．３ 实验设计及分组：［１５，１６］参照药效学、毒理学试验及GI公司申报资料，设四个剂量s.c.组(剂量分别为50、100、200和400?g.kg-1)和一个i.v.组(100 ?g.Kg-1)。采用i.v.组与相同剂量的s.c.组交叉设计，自身比较计算生物利用度；s.c.50 ?g. kg-1组与s.c.400?g. kg-1组交叉设计，观察剂量对血药浓度的影响；s.c.200?g.kg-1组连续给药7天，观察连续给药对血药浓度的影响。随机分组，每组3只（雌1只，雄2只），交叉试验动物在接受第一种交叉用药(途径或剂量)后间隔18天药物清除期接受第二种交叉用药(途径或剂量)。经后肢i.v.或s.c.注药，i.v组于注药前及药后0.017、0.083、0.17、0.33、0.67、1、2、4、8和24h；s.c.组于注药前及药后
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0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、12和24h从对侧后肢静脉取血；连续给药组在第1和第7给药周期按上述s.c.组取血时间取血，第3和第5给药周期于药前、药后1、1.5和24 h取血。分离血清，-20℃保存待测；部分动物取药后2h尿待测。
２．４ 血清rhIL－１１浓度的测定：美国R&D Systems公司产Quantikine D1100药盒，ELISA法测定血清rhIL-11浓度，药盒批号：9906222。 ２．５ 测试原理：［１７］夹心饼干双抗体法。微板专一性抗rhIL-11单抗预包被，加入含血清IL-11或标准培育。IL-11与板上固化抗体结合。洗涤去除过量血清或标准后，每孔加入抗rhIL-11多克隆抗体-辣根过氧化物酶结合物，再培育，抗体酶结合物与板上固化IL-11结合，洗涤去除过量结合物。加显色剂，酶氧化形成蓝色复合物，加酸终止反应，颜色转黄，成色量与IL-11-抗体复合物结合物量成正比，与血清或标准内所含IL-11量成正比。复合物吸光率和标准IL-11浓度绘制标准曲线，计算未知样品浓度。标准品经高纯度NIBSC/WHO IL-11 92/788校正。剂量反应曲线与Quantikine标准平行。试剂盒测定的样品值与NIBSC92/788单位换算等式为：NIBSC(92/788)当量(U/mL) = 0.011? Quantikine IL-11值(pg/mL) ２．６ 测定步骤： 96孔板每孔加50??L被分析稀释液，100 ?L药盒标准或血清，重复2孔，胶条封板培育2 h，洗涤液洗板4次，吸干液体，加200 ?L人多抗－辣根过氧化物酶结合物，封板再培育1 h，洗板，吸干液体，加200 ?L显色剂，室温30 分钟后加50 ?L终止液，用Denley Wellscan MK-2型酶标仪测定450 nm OD值，参比波长为540 nm。按各板标准曲线计算同一板血清内或标准rhIL-11浓度。
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２．７ 药代动力学参数估算和统计： 用3p97实用药代动力学计算程
序[18]估算药动学参数，用t和F检验进行统计学判断。实验结果线性回归用Microcal Origin软件。
３．结果
３．１ ELISA检测猴血清rhIL－１１浓度的可靠性检验 ３．１．１ 灵敏度：
按说明书最低检测量为20个零浓度标准重复测得平
均OD值的2个标准差，经标准曲线换算为8 pg.mL-1。实验按相同方法获得最低检测量为14 pg.mL-1。 ３．１．２ 特异性：
说明书称测定可识别rhIL-11与天然人IL-11(nhIL-
11)；曾与93种人、鼠或其它细胞因子或受体及相关蛋白在浓度50 ng.mL-1时交叉试验未显示任何反应。本实验室中发现空白猴血清本底接近零，也证明药盒与猴血清各种内源性蛋白交叉反应非常低。
３．１．３ 血清加入rhIL－１１回收率：地奥公司rhIL-11加入血清的回收率为85.9 ± 5.0%(76.2 %～93.5 %, Tab1)，R&D公司rhIL-11加入血清的回收率为88.0 ± 8.8 %(71.9～105.6 %, Tab2)，与药盒说明书报告平均回收99% (89 %～117 %)数值相近。
Ｔａｂ１
39 156 625 2500 平均
地奥公司rhIL-11加入猕猴血清的回收率（％）
76.2 79.9 87.8 89.7
78.2 86.4 93.5 88.7
81.0 81.1 87.1 84.8
89.5 87.2 93.3 89.7
81.2 ± 5.8 83.7 ± 3.7 90.4 ± 3.5 88.2 ± 2.3 85.9 ± 5.0
7.2 4.4 3.8 2.6 5.9
加入量(pg.mL-1) 回收率1 回收率2 回收率3 回收率4 均数±标准差 CV％
Ｔａｂ２ R&D公司产rhIL-11加入猕猴血清的回收率（％）
n 加入量（pg.mL-1） 回收率范围 均数±标准差 CV％
62.5 8 9.2 76.9 ～ 100.6 86.9 ± 8.0
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250 1000 平均
10 10 28
80.6 ～ 105.3 71.9 ～ 105.6 71.9 ～ 105.6
91.3 ± 8.0 85.8 ± 10.4 88.0 ± 8.8
8.8 12.2 10.0
３．１．４ 线性关系，精密度和线性浓度范围： 药盒rhIL-11标准品在31.25～2000 pg.mL-1范围内线性关系良好(Tab3，Fig1)。10次重复测定相关系数均大于 0.99；药盒标准曲线和地奥产rhIL-11标准曲线斜率相同，同一板内斜率分别为0.960 ? 0.006和 0.979 ? 0.018，相关系数均为0.999(Tab4，Fig2)。Tab5为平均批内精密度，在线性区内波动于10 %以内。8次批间精密度见Tab6，在线性区内波动于20 %以内。实验各板分别设标准曲线，范围为31.25～2000 pg.mL-1，对于rhIL-11含量超过此范围的样品用药盒提供的稀释液适当稀释至此浓度范围进行测定。
方法学的可靠性检验结果表明R&D Systems公司药盒ELISA法测定rhIL-11浓度的灵敏度、特异性、线性、线性范围、精密度和回收率均能满足药代动力学研究的要求，本实验室重复测试结果与药盒说明书提供的数据相近。表明用本法测定生物样品中的rhIL-11是可信的。
Ｔａｂ３ R&D Systems药盒提供rhIL-11标准的校正曲线
加入IL11(pg.mL-1)
0 31.25 62.5 125 250 500 1000 2000
OD 1 0.050 0.094 0.135 0.206 0.345 0.629 1.205 2.275
OD 2 0.049 0.093 0.133 0.201 0.337 0.639 1.097 2.252
均数±标准差 0.050±0.001 0.094±0.001 0.134±0.001 0.204±0.004 0.341±0.006 0.634±0.007 1.151±0.076 2.264±0.016
CV % 1.4 0.8 1.1 1.7 1.7 1.1 6.6 0.7
双对数线性回归方程：Ｙ＝－２．７７（±０．０２）＋０．９４（±０．０１）Ｘ， 相关系数Ｒ ＝ ０．９９９
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Ｔａｂ４
加入IL11(pg.mL-1)
0 39.1 78.1 156 312 625 1250 2500 5000
OD 1 0.070 0.098 0.123 0.181 0.292 0.505 0.980 1.797 2.893
地奥产rhIL-11的标准曲线
OD 2 0.078 0.104 0.127 0.187 0.304 0.541 0.957 1.756 2.855
均数±标准差 0.074±0.006 0.101±0.004 0.125±0.003 0.184±0.004 0.298±0.008 0.523±0.025 0.969±0.016 1.777±0.029 2.874±0.027
CV % 7.6 4.2 2.3 2.3 2.8 4.9 1.7 1.6 0.9
双对数线性回归方程：Ｙ＝－３．１１（±０．０５）＋０．９８（±０．０２）Ｘ，相关系数Ｒ ＝ ０．９９９
Ｆｉｇ１ R&D药盒rhIL-11标准校正曲线
1OD值0.10.0110
100
rhIL-11 (ng.L-1)
1000
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双对数线性回归方程：Ｙ＝－２．７７（±０．０２）＋０．９４（±０．００９）Ｘ，相关系数Ｒ ＝ ０．９９９８
Ｆｉｇ２ 地奥产rhIL-11标准校正曲线（?）和R&D药盒
rhIL-11标准校正曲线（?）比较
斜率分别为０．９６０ ? ０．００６和 ０．９７９ ? ０．０１８，相关系数均为０．９９９以上。
地奥公司产rhIL-111OD值R&D公司产rhIL-11 0.10.0110
1001000
rhIL-11 (ng.L-1)
Ｔａｂ５
加入不同量rhIL-11的平均批内精密度
n 8 8 8 8 8
平均批内CV %±标准差
7.30 ± 0.07 3.66 ± 0.02 3.10 ± 0.01 2.62 ± 0.01 5.19 ± 0.06
加入IL-11量(pg.mL-1)
0 31.2 62.5 125 250
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500 1000 2000
Ｔａｂ６
rhIL-11
1
2
8 8 8
2.59 ± 0.03 3.14 ± 0.02 1.29 ± 0.02
加入不同量rhIL-11 (pg.mL-1)的批间精密度
3
4
5
6
7
8
均数±标准差 CV %
0 0.050 0.049 0.045 0.060 0.087 0.059 0.067 0.074 0.061±0.014 23.2 31.25 0.094 0.106 0.093 0.114 0.134 0.103 0.137 0.133 0.114±0.018 16.0 62.5 0.134 0.156 0.137 0.222 0.170 0.146 0.195 0.189 0.168±0.031 18.5 125 250
0.204 0.240 0.210 0.258 0.249 0.225 0.310 0.305 0.250±0.040 16.0 0.341 0.415 0.348 0.445 0.413 0.367 0.484 0.516 0.416±0.063 15.2
500 0.634 0.744 0.645 0.737 0.705 0.664 0.930 0.911 0.746±0.115 15.4 1000 1.151 1.541 1.266 1.260 1.441 1.234 1.761 1.735 1.423±0.235 16.5 2000 2.264 2.455 2.161 2.169 2.414 2.076 2.691 2.524 2.344±0.211 9.0 批内r 0.9998 0.9992 0.9996 0.9992 0.9994 0.9997 0.9989 0.9982 0.999±0.0005 0.05
３．２ 猕猴皮下或静脉注射不同剂量rhIL-11后血和尿中药物浓度
各组猕猴皮下注射50、100、200和400 ?g.kg-1及静脉注射100
?g.kg1 rhIL-11后平均血药浓度变化见Tab7和Fig3。9只猕猴正常血清可测到极低浓度的IL-11，其中4只低于检测灵敏度，平均为0.010 ± 0.013 ng.mL-1；经18天药物清洗期后接受第二种交叉用药的途径或剂量前的IL-11浓度平均为0.012 ± 0.015 ng.mL-1，两者无统计差别。连续给药组第7次药后与第1次比较峰浓度相似，但达峰时间后移(见Fig4）。
猕猴皮下注射100 ?g.kg-1rhIL-11后2h尿中未检测到rhIL-11。
３．３ 猕猴皮下或静脉注射不同剂量rhIL-11后药代动力学
Tab8是猕猴s.c.或i.v.注射不同剂量rhIL-11后血药浓度按血管外一
级吸收一房室模型或静脉二房室开放模型和非房室模型估算所得的药代动力学参数。其特点是：
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３．３．１各剂量或途径给药组的末端半衰期相近：单次i.v.后末端消除相半衰期为2.8 ± 0.4 h。单次s.c. 50、100、200和400 ?g.kg-1后四个剂量后分别为3.6 ± 0.6、3.6 ± 0.2、3.6 ± 0.7和3.6 ± 1.0 h。各组间均无统计意义的差别。
３．３．２ 皮下吸收过程不依赖于剂量或浓度：一次s.c. 50、100、200和400 ?g.kg-1后t1/2Ka分别为0.2 ? 0.2、0.3 ? 0.2、0.34 ? 0.03和0.3 ? 0.2 h，TPEAK分别为1.2 ?0.3、1.0 ? 0.0、1.3 ? 0.3和1.0 ? 0.0 h，未表现出吸收过程受s.c.部位rhIL-11浓度或剂量限制的特征。
３．３．３ AUC与s.c.剂量基本成正比：在实验研究的剂量范围内，s.c.注射的剂量比为1:2:4:8，，AUC比为1:2:8:12，两者基本呈线性相关(r = 0.97，n = 4，P = 0.029)；单次s.c. 50、100、200和400 ?g.kg-1后全身清除率CLS分别为0.70 ? 0.01、0.60 ? 0.13、0.35 ? 0.15和0.46 ? 0.08 L.kg-1-1
h，剂量组间比值为1.0:0.9:0.5:0.7。各组间配对t-检验和F-检验都无统
计意义的差异，表明药物在体内的总过程符合线性动力学。
３．３．４皮下吸收的生物利用度：相同剂量交叉设计自身比较时s.c.的平均生物利用度为0.68 ? 0.15。
３．３．５连续皮下注射后的药代动力学 s.c.200 ?g.kg-1.d-1?7d后第1周期和第7周期AUC分别为631 ± 242和901 ±196 ng.ml-1.h，个体差异较大，无统计差别；末端半衰期分别为3.6 ± 0.7 h和3.7 ± 1.7 h；全身清除率分别为0.35 ± 0.15和0.25 ± 0.04 L.kg-1h-1，峰浓度分别为202 ±121 和146 ±17 ng.mL-1;以上参数均无统计意义的差别，达峰时间分别为1.3 ± 0.3 h和2.0 ± 0.0 h明显后延(P<0.05)。3只动物蓄积比(AUC第7周期 / AUC
第1周期
)个体差异性较大，一只大于1；一只接近1；一只小于1。因此就总
体而言，表现出轻微的时间依赖性药代动力学。
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Ｔａｂ７
时间(h)
0 0.017 0.083 0.17 0.33 0.50 0.67 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 8.0 12 24
50 ?g.kg-1
4.2 ? 0.29 kg 0.0 ? 0.0 ― ― ― ― 19 ? 13 ― 26 ? 10 22 ? 15 13 ? 4 9.8 ? 2.7 7.8 ? 1.4 5.3 ? 0.9 2.2 ? 0.9 0.9 ? 0.6 0.12 ? 0.07
100 ?g.kg-1
4.0 ? 0.5 kg 0.01 ? 0.02
― ― ― ― 25 ? 5 ― 53 ? 20 34 ? 0 32 ? 10 20 ? 4 22 ? 14 14 ? 9 5.5 ? 2.8 2.0 ? 1.9 0.3 ? 0.2
猕猴皮下或静脉注射不同剂量rhIL-11后血清药浓度变化
(ng.mL-1；均数±标准差；N＝3)
s.c. 200 ?g.kg-1 （第1周期） 4.0 ? 0.5 kg 0.01 ? 0.01
― ― ― ― 115 ? 88 ― 191 ? 127 197 ? 114 80 ? 36 71 ? 34 62 ? 35 32 ? 4 21 ? 6 11 ? 6 0.9 ? 0.6
200 ?g.kg-1 （第7周期）
1.01 ? 0.06**
― ― ― ― 64 ? 35 ― 92 ? 26 * 117 ? 23 ** 146 ? 17 **#
，，，##
i.v.
400 ?g.kg-1
0.02 ? 0.02
― ― ― ― 168 ? 73 ― 342 ? 192 198 ? 0 138 ? 37 * 129 ? 38 * 100 ? 30 * 49 ? 12 * 31 ? 8 * 14 ? 8 1.3 ? 1.0
100 ?g.kg-1
0.01 ? 0.02 1185 ? 913 718 ? 486 463 ? 356 222 ? 149 ― 90 ? 26 60 ? 36 ― 7 ? 4 ― ― 1.5 ? 0.9 * 0.24 ? 0.09
― 0.04 ? 0.03
137 ? 20 **# 129 ? 23 *#
，
103 ? 32 * 40 ? 16 10 ? 5 5 ? 4
*或**，和s.c. 50?g.kg-1剂量组相应时间点比较时，Student’s t-检验P<0.05 或
-1
P<0.01。#或##，与s.c. 200?g.kg剂量组第1次给药周期相应时间点比较时，Student’s t-检验 P<0.05 或 P<0.01。
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
1000100rhIL-11(ng.mL-1)1010.10.010510152025药后时间（ｈｒ）Ｆｉｇ３
猕猴皮下或静脉注射不同剂量ｒｈＩＬ－１１后血清药浓度－时间
曲线
测定方法： ELISA，各点为实测均数±标准差，n = 3。i.v. 100 ?g.kg-1(?);
s.c.50?g.kg-1 (?); s.c.100 ?g.kg-1(?); s.c.200?g.kg-1(?)； s.c.400 ?g.kg-1(?)。图内各线是按拟合参数计算的浓度，显示拟合的优度；注意各皮下注射剂量组末端相对数浓度表现为一系列平行线。
300250 估算值 实测值rhIL-11(ng.mL-1)200150100500024487296120144168首次药后时间（ｈ）吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ４ 猕猴多次皮下注射rhIL-11 200?g.kg-1.d?7d血清药浓度变化
测定方法： ELISA，各点(?)为实测均数±标准差，n = 3。图内虚线 ( )为按第一周期浓度-时间数据估算的7次重复多次给药的预测曲线。实测值与预测值基本重叠。
Ｔａｂ８
猕猴皮下或静脉注射不同剂量 ｒｈＩＬ－１１后药代动力学参数
（均数±标准差；N＝3)
s.c.
i.v.
50 ?g.kg-1 100 ?g.kg-1 200 ?g.kg-1 200 ?g.kg-1 400 ?g.kg-1 100 ?g.kg-1
(第1周期) (第7周期) 166 ? 160 101 ? 43 1268 ? 822 384 ? 333 745 ? 386 2389 ? 479 5.1 ? 4.3 19 ? 8 57 ? 22 619 ? 434 75 ? 40 0.98 ? 0.09 963 ? 383 1240 ? 421 734 ? 472 733 ? 125 989 ? 156 44 ? 10 0.6 ? 0.5 0.8 ? 0.3 0.5 ? 0.1 2.0 ? 0.5 0.8 ? 0.3 0.19 ? 0.02 3.6 ? 0.6 3.6 ? 0.2 3.6 ? 0.7 3.7 ? 1.7 3.6 ? 1.0 2.8 ? 0.4
― 0.2 ? 0.2 0.3 ? 0.2 0.34 ? 0.03 1.1 ? 0.1* 0.3 ? 0.2
0.70 ? 0.01 0.60 ? 0.13 0.35 ? 0.15 0.25 ? 0.04 0.46 ? 0.08 0.50 ? 0.23 81 ? 17 182 ? 62 631 ? 242 901 ? 196 * 953 ? 99 292 ? 169 3.8 ? 1.3 3.8 ? 1.1 4.5 ? 1.0 5.2 ? 1.1 4.1 ? 1.1 0.5 ? 0.1
― 1.2 ? 0.3 1.0 ? 0.0 1.3 ? 0.3 2.0 ? 0.0 *,& 1.0 ? 0.0
― 27 ? 12 53 ? 20 202 ? 121 146 ? 17 * 342 ? 192
― ― ― ― ― 0.68 ? 0.15
参数
A B
VC/F, VC T1/2? T1/2末端 T1/2Ka CLS AUC0-Z MRT TPEAK CMAX F#
单位 ng.mL-1 ng.mL-1 mL.kg-1 h h h
L.kg-1h-1 ng.h.mL-1 h h
ng.mL-1
# ：皮下或静脉注射100 ?g.kg-1交叉设计自身比较计算的生物利用度。TPEAK和CMAX为实测值，梯形法计算AUC0-Z其中Z为最末测定时间点；*和&：与50 ?g.kg-1和与200 ?g.kg-1第一给药周期比较时Student’s t-检验P<0.05。
４． 猕猴皮下或静脉注射不同剂量的ｒｈＩＬ－１１后外周血血小板计数变化及其与血清ｒｈＩＬ－１１浓度间的关系［１９］
４．１ 外周血小板计数的增高依赖于给药剂量和次数
在测定猕猴血清rhIL-11浓度的同时观察了外周血血小板计数(PLT)
变化。结果表明正常猕猴皮下注射单剂量rhIL-11 400?g.kg-1和s.c. 200
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
?g.kg-1.d1?7d后PLT比给药前平均值明显增高(P<0.05)，净增强度(净增%?时间)分别为589 ? 610和753 ? 308。显示了依赖于剂量和给药次数的作用。s.c. rhIL-11血清浓度达峰时间TPEAK为1 ~ 2 hr，PLT数延后至给药后第5-6天开始增高，第8~9天达到峰值，给药后17-19天恢复给药前水平(Tab9，Fig5)。
Ｔａｂ９猕猴皮下或静脉单次或连续注射不同剂量后外周血血小板计数的变化
给药方案
剂量 ?g.kg-1 50 100 100 400 200
给药 途径 s.c. s.c. i.v. s.c. s.c.
给药 次数 1 1 1 1 7
开始 d ― ― ― 5.0 ? 1.7 6.7 ? 1.2
外周血血小板计数增高 峰值 d ― ― ― 9.3 ? 1.2 8.7 ? 2.3
恢复 d ― ― ― 15.7 ? 5.5 17.7 ? 2.9
净增强度 %?d 92 ? 158 35 ? 76 -27 ? 164 589 ? 610 753 ? 308
连续注射终止1000800
开始注射ｒｈ－ＩＬ－１１血小板计数6004002000-10-50510152025时间 （ ｄａｙ ）吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ５ 猕猴皮下单次注射rh-IL-11 50 ?g.kg-1（?），100 ?g.kg-1（?）和400 ?g.kg-1
（?）］和多次连续皮下200 ?g.kg-1.d-1 ? 7d（?）及静脉注射100 ?g .kg-1（?）后外周血血小板计数（?109 L-1）的变化；显示依赖于剂量和次数的增高。图中各点为平均数?标准差（n ＝ ３）。
４．２ 全身ｒｈＩＬ－１１曝露量和外周血小板变化增高程度的相互关系
血清rhIL-11峰浓度和浓度增高持续时间单独都与PLT的增高程度
无直接关系，然而rhIL-11的全身曝露量(systemic exposure intensity，单位是血清浓度与时间乘积，C ? T，其中多次给药采用估算浓度)与PLT增高程度呈正相关， r = 0.697 (n = 15, P = 0.00387)。(Fig6）。
血小板净增强度（％×ｄ）1400120010008006004002000-20001000200030004000500060007000?ｇ．Ｌ－１．ｈ）全身暴露量（ Ｆｉｇ６ 重组人白细胞介素１１（ｒｈＩＬ－１１）全身曝露量（血清浓度乘时间， C ? T，多次
给药为估算浓度）和PLT增高程度（PLT净增百分率与时间的乘积， % ? T）的相关性。图中各点为1只猴的曝露量和PLT净增程度。其中(?)为 s.c. 50 ?g.kg-1组；(?)
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为 s.c. 100 ?g.kg-1组; (?)为 i.v. 100??g.kg-1； (?)为 s.c. 400 ?g.kg-1组；而(?)为 s.c. 200??g.kg-1.d-1?7d组。线性相关系数r = 0.697 (n = 15, P = 0.00387)。
第二部分
重组人白细胞介素－１１（ｒｈＩＬ－１１）在小鼠体内的分布和排泄
１． ｒｈＩＬ－１１的
１２５
Ｉ－标记、放化纯度及生物活性鉴定
１．１ 目的和要求
根据ICH-S6生物技术来源药物的临床前安全评价的技术要求，
“使用放射性标记蛋白时，重要的是显示放射性标记的受试物质仍保留与非标记物质等同的活性和生物学性质”。本实验目的是用ＳＨＰＬＣ和体内升高外周血血小板计数的作用鉴定标记ｒｈＩＬ－１１的放化纯度和生物学活性，确定标记ｒｈＩＬ－１１是否符合药代动力学研究要求。 １．２ 试验材料和方法
１．２．１ 放射性标记：[20]称取Iodogen (军事医学科学院毒物药物研究所合成)1mg溶于0.5 mL氯仿中，取50?L(100?g)加至试管底部，用氮气吹干，加不含保护剂的人基因工程白细胞介素-11(rhIL-11)半成品(成都地奥制药公司产，批号:981201，纯度>95 %，浓度1 mg.mL-1 )2.0 mL，加Na125I(Amersham公司产，批号826A，放化纯度>99%，比活度581MBq.?gI)36.7 MBq，20?C反应12 min，反应过程不断摇动，使反应充分。
１．２．２ 标记反应物的分离纯化：将标记反应混合物加在1×50cm的Sephacryl S-200 HR (Pharmacia)凝胶柱上分离纯化，洗脱液：0.01mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1 NaCl，pH7.0，流速12 mL.h-1。分部收集洗脱液，Wallac 1470?计数仪测定?放射性。
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１．２．３ 放化纯度鉴定：分子排阻高效液相色谱(SHPLC)法。HP1100四元泵，TSK-GEL G3000WXL分子排阻柱，300×7.8 mm，洗脱液：0.01 mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1NaCl，pH7.0，流速1.0 mL.min-1。分部收集洗脱液， Wallac 1470?计数仪测定?放射性。计算和标准非标记rhIL-11层析行为相同放射性峰的放射性%。
１．２．４ 蛋白含量测定：考马斯亮蓝G-250(GBBG-250)染料结合法。96孔板每孔加50 ?L标准牛血清白蛋白(0.5 - 5.0 ?g)或未知样品，再加150 ?L GBBG-250染料液混匀，室温放置5分钟，用酶标仪测定595 nm光吸收值，绘制标准曲线，经线性回归，计算未知样品的蛋白含量。
１．２．５体内升高外周血血小板计数的活性检定：C57小鼠(军事医学科学院实验动物中心)，雌雄兼用，分为两组，每组5只，分别皮下注射125I-rhIL-11 4.0 ?g/鼠/天 (18.4 KBq/鼠，200?g.Kg-1)或相同蛋白剂量的未标记rhIL-11，两组均连续给药5天，每天给药2次，于药前及药后第2，4，5，6，8，10天分别取血，在相差显微镜下计数血小板。 １．３ 试验结果
１．３．１ Sephacryl S-200 HR层析分离纯化的放射性和蛋白图谱： 标记混合物在Sephacryl S-200 HR层析上的放射性和蛋白图谱重叠(见Fig1)，125I-rhIL-11洗脱体积为43 mL，蛋白回收率为44.0%，放射性回收率为91.7%，蛋白质标记率为87.4 %。
）放射活性（ＭＢｑ．－ｍ１Ｌ4 放射活性 蛋白100蛋白（ｕｇ．ｍ－Ｌ１）
321001075502502030405060洗脱体积（ｍＬ）吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ １ 标记混合物的Sephacryl S-200 HR层析的放射性和蛋白图谱 Sephacryl S-200 HR凝胶柱，1×50 cm，洗脱液：0.01 mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1 NaCl，pH7.0，流速12 mL.h-1。显示放射性峰和蛋白峰重叠。
１．３．２ 125I-rhIL-11的放化纯度： Fig2是纯化后鉴定125I-rhIL-11纯度的SHPLC图谱，125I-rhIL-11的洗脱体积为10.8 mL，放化纯度96.1 %，三次重复测定纯度为95.0±1.4 %。125I-rhIL-11的比活度为3.6 kBq/?g蛋白。
1.21.0放射性（Ｂｑ）0.80.60.40.20.0010203040 洗脱体积（ｍＬ）Ｆｉｇ２ 125I-rhIL-11的SHPLC放化纯度鉴定图谱
HP1100四元泵，TSK-GEL G3000WXL分子排阻柱，300×7.8 mm，洗脱液：0.01 mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1NaCl，pH7.0，流速1.0 mL.min-1。125I-rhIL-11洗脱体积为10.8 mL，放化纯度为96.1%。
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１．３．３ 125I-rhIL-11升高外周血血小板生物活性： Tab1和Fig3是标记和未标记rhIL-11对C57小鼠血小板计数的影响，125I-rhIL-11有促血小板增高作用，血小板计数以注射前的百分率表示，血小板于药后第6天达峰值。标记药物与未标记药物刺激血小板增殖的高度和持续时间相近。表明125I-标记对活性无明显影响。
200 标记后 标记前 150
100
0246810
药后时间（天）
50
Ｆｉｇ３ C57小鼠皮下注射125I-rhIL-11（?， 4?g ／ 鼠／天?5天或18.4 KBq ／ 鼠／天?5天）和未标记rhIL-11（?， 4?g ／ 鼠／天?5天）后外周血小板计数的变化。血小板数以注射前计数值的百分数表示，图内数值为平均数?标准差, n=5。显示125I-rhIL-11刺激小鼠血小板增高的程度和持续时间与未标记rhIL-11非常接近。
Ｔａｂ１ C57小鼠s.c.125I-rhIL-11（４ ?ｇ／鼠／天?５天或１８．４ KBq／鼠／天?５天）和未标记rhIL-11（４ ?ｇ ／ 鼠／天?５天）对外周血小板计数的影响
(给药前均值的％， 均数?标准差, n=5) 125
检查时间I-rhIL-11 4?g / 鼠/天?5天 rhIL-11 4?g / 鼠/天?5天
-5 98.9 ? 4.4 97.2 ? 4.4 -3 101.1 ? 4.4 102.8 ? 4.4 0（平均） 100.0 ? 0.0 100.0 ? 0.0
2 121.7 ? 17.3* 122.0 ? 11.7* 4 137.5 ? 16.8** 140.1 ? 21.6* 6 148.6 ? 24.3* 146.8 ? 23.2*
外周血小板（％）吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
108.8 ? 9.3 103.1 ? 12.4
＊
和＊＊：与本组药前值比较，Student’s t-test P<0.05和P<0.01。
10
２． 基因重组人白细胞介素－１１（ｒｈＩＬ－１１）在小鼠体内的分布、排泄、蛋白结合及体内降解
２．１ 目的和要求
采用放射性标记结合SHPLC和TCA酸沉淀法研究125I-rhIL-11在
小鼠体内代谢降解的性质；在靶器官和生命重要器官组织中分布的时间过程，是否有蓄积；排泄的途径和时间过程，排泄物的形式等。 ２．２ 试验材料和方法 ２．２．１ 动物 ：
C57小鼠(军事医学科学院动物中心生产 )，体重20.6
± 1.2 g(均数±标准差)，随机分组，每组6只，雌雄各半。
２．２．２ 给药途径和剂量： 小鼠药效学实验低、中、高剂量分别相当于100、200和400 ?g/kg，本实验剂量为每只小鼠于背部皮下(s.c.)注射125I-rhIL-11 4 ?g(18.4 ＫBq/鼠，200?g/kg)，相当于药效学的中剂量。 ２．２．３ 分布实验： 于注射后20 min、1.5、3 和 8 h 分别经股动脉放血活杀6只动物(♂3只，♀3只)，取全血、血清、心、肺、脾、双侧股骨骨髓、肠系膜淋巴结、胸腺、骨骼肌、脑、脂肪、性腺、肾上腺、甲状腺、肝、胆汁、小肠、小肠内容物、结肠内粪、肾、膀胱、尿和注射部位皮肤等组织或体液。液体用微量吸管计量，组织放在塑料小杯内用感量0.1 mg的电子天平称湿重，制成匀浆，加入等量20 %TCA沉淀蛋白，测定组织总放射性；离心后去上清，用10 %TCA洗涤一次，然后测定酸沉淀部分?放射性。以Bq/g新鲜湿重表示放射性浓度。对部分血清和尿样品进行SHPLC分析。
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２．２．４ 排泄实验： 6只鼠(♂3只，♀3只)给药后单个饲养在代谢笼内，喂以本院标准饲料，自由饮水，定期收集粪和尿，观察到给药后72 h 。 ２．２．５分子排阻高效液相色谱（SHPLC）： HP1100四元泵，TSK-GEL G3000WXL分子排阻柱，300×7.8 mm，洗脱液：0.01 mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1NaCl，pH7.0，流速1.0 mL.min-1。分部收集洗脱液， Wallac 1470?计数仪测定?放射性。分别计算样品中125I-rhIL-11、125I-结合物和125I-降解物放射性峰的?放射峰面积，换算为样品总放射性%，经放射性衰变、比活度和仪器计数效率校正，换算成血清125I-rhIL-11浓度(ng/mL)。
２．２．６ 体外血清蛋白结合：将不同量125I-rhIL-11加至正常鼠血清中，室温2分钟后进行SHPLC分析。
３．试验结果
３．１ SHPLC检测血清
125
I-rhIL-11的可靠性认证
SHPLC检测125I-rhIL-11的特异性取决
３．１．１ 检测方法的特异性：
于标记rhIL-11的纯度和SHPLC的分辨率。125I-rhIL-11洗脱体积为10.8mL，分离条件可有效分离原形125I-rhIL-11、125I-结合物和小分子125I-降解物。 ３．１．２ 灵敏度：
方法灵敏度取决于125I-rhIL-11的比放射活度和放射
性测量时间。实验对测量精度控制在< 7 cv%。最低检出量定义为SHPLC连续5个洗脱管的计数超过本底20个CPM或总计>100CPM，经衰变校正、计数效率校正和比活度和回收率校正后，相当于3 pg.mL-1血清。 ３．１．３ 线性和精密度：
Ｔａｂ2和Fig4表明正常血清加入125I-rhIL-11量
在3.0～53.2pg范围内SHPLC检测的线性关系良好，125I-rhIL-11量与
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125
I- rhIL-11峰相关系数r=0.9994，p=0.0006，变异系数cv%为6.8～9.2
%。
Ｔａｂ２ 正常小鼠血清加入125I-rhIL-11量与 SHPLC检测放射性峰（Bq）的线性及精密度
125I-rhIL-11(pg) 样品1(Bq) 样品2(Bq) 均数?标准差(Bq)
3.0 6.25 5.68 5.96 ? 0.40 16.5 19.24 21.25 20.24 ? 1.42 53.2 64.25 73.19 68.72 ? 6.32
cv% 6.8 7.0 9.2
Ｉ－ｒｈＩＬ－１１放射峰（Ｂｑ）80ｙｓｃａｌｅ（Ｙ） ＝ Ａ ＋ Ｂ ＊ ｘｓｃａｌｅ（Ｘ）Ａ ＝ ０．５５５７６Ｂ ＝ １．２７５０６Ｒ ＝ ０．９９９１９604020１２５0010１２５2030405060Ｉ－ｒｈＩＬ－１１含量（ｐｇ）125
I-rhIL-11 SHPLC检测的线性及精密度
125
３．１．４ 血清回收率：I-rhIL-11加入正常血清后部分与血清蛋白结合形成大分子结合物，SHPLC测定游离原形125I-rhIL-11的回收率为51.9 %±12.5 % (42.0 %～63.9 %，n = 3)，游离原形125I- rhIL-11 + 大分子结合物的总回收率为88.7 %±9.2 %(81.6 %～96.0 %，n =3)。
Ｆｉｇ４ 正常小鼠血清加入
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Ｔａｂ３ SHPLC测定 125I- rhIL-11的血清回收率（%） 125I-rhIL-11(pg) 原形 原形+大分子结合物
3.0 42.0 ? 9.8 81.6 ? 10.5 16.5 55.0 ? 8.1 92.0 ? 0.1 53.2 63.9 ? 8.9 96.0 ? 3.3 平均 51.9 ? 12.5 88.7 ? 9.2
３．２ 三氯醋酸（TCA）沉淀法测定组织125I-rhIL-11的方法学认证 ３．２．１ 检测方法的原理和特异性 标准125I-rhIL-11是分子量为19 kDa的标记蛋白，在10 %TCA中放射性主要在可被沉淀部分，样品离心后去除上清，可沉淀部分代表原形药物和其它分子量较大的125I-标记物。125I-小分子降解代谢物在上清酸溶部分中。 ３．２．２ 灵敏度： ３．２．３ 线性： 0.99。
３．２．４ 回收率：
方法灵敏度取决于125I-rhIL-11的比活度和放射性测Tab4和Fig5表明不同组织加入125I-rhIL-11在1.8～
量时间。最低检出量约为5 Bq.g-1组织湿重。
98.3 pg范围内与TCA沉淀放射性的线性关系良好，线性相关系数均大于
不同组织加入标准125I- rhIL-11，TCA可沉淀部分的
放射性回收率为加入放射性的86.2 ? 5.6 %。
Ｔａｂ４ 不同组织加入1.8～98.3 pg 125I-rhIL-11与 总放射性和TCA沉淀放射性的线性关系
总放射性 酸沉放射性 组织
斜率 ? 标准差 相关系斜率 ? 标准差 相关系数
1.00000 0.99996 缓冲液 4.54?0.01 3.60?0.02 0.99810 0.99641 血清 4.51?0.12 3.73?0.13 0.99981 0.99977 心脏 4.49?0.03 3.86?0.03 0.99974 0.99998 肝脏 4.56?0.04 4.07?0.03 0.99991 0.99990 脾脏 4.56?0.03 4.02?0.02 1.00000 0.99988 肺 4.56?0.03 4.05?0.02
回收率
（%） 75?6 82?5 87?1 89?4 87?2 90?2
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
肾脏 脑 脂肪 肌肉 小肠 粪 肠内容
5004.67?0.14 4.54?0.02 4.57?0.10 4.53?0.09 4.70?0.09 4.60?0.05 4.44?0.04
0.99775 0.99990 0.99875 0.99893 0.99883 0.99952 0.99978
4.12?0.11 3.91?0.02 3.98?0.08 4.10?0.04 4.05?0.04 4.03?0.03 3.81?0.04
5000.99767 0.99986 0.99889 0.99964 0.99958 0.99970 0.99950
87?5 84?6 88?1 87?5 90?7 89?5 87?6
放射性（Ｂｑ）放射性（Ｂｑ）40030020010000血清40030020010000心脏2040125608010020401256080100I-rhIL-11(pg)500I-rhIL-11(pg)50030020010000放射性（Ｂｑ）放射性（Ｂｑ）400肝脏40030020010000脾脏2040125608010020401256080100I-rhIL-11(pg)I-rhIL-11(pg)500500放射性（Ｂｑ）放射性（Ｂｑ）40030020010000肺脏40030020010000肾脏2040125608010020401256080100I-rhIL-11(pg)I-rhIL-11(pg)吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
125
Ｆｉｇ５－１ 不同组织加入I-rhIL-11量与TCA沉淀放射性的线性关系
500
脑放射性（Ｂｑ）5004003002001000
放射性（Ｂｑ）4003002001000脂肪020401256080100020401256080100I-rhIL-11(pg)I-rhIL-11(pg)500500放射性（Ｂｑ）30020010000放射性（Ｂｑ）400肌肉40030020010000小肠2040125608010020401256080100I-rhIL-11(pg)500I-rhIL-11(pg)500放射性（Ｂｑ）放射性（Ｂｑ）4003002001000粪40030020010000肠内容02040125608010020401256080100I-rhIL-11(pg)I-rhIL-11(pg)吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ５－２ 不同组织加入
125
I-rhIL-11量TCA沉淀放射性的线性关系
３．３ 小鼠s.c.125I-rhIL-11后不同时间各组织中的分布
Tab5~7分别是小鼠s.c.125I-rhIL-11后不同时间各组织总放射性、
TCA酸可沉淀放射性和酸可沉淀放射性与总放射性的比值，Fig6是小鼠s.c.125I-rhIL-11后1.5h不同组织酸可沉淀放射性按浓度高低排列的分布。
总放射性分布特点是除甲状腺外泌尿排泄系统浓度最高，肝脏、
骨髓高于血清，其它组织均低于血清，甲状腺总放射性随药后时间延长而增高，药后20 min仅占注入量的0.3?0.1%，8 h达3.3?1.5%，故不影响分布试验的可靠性。注射部位总放射性性随药后时间而降低，20 min残留放射性高达52.9 ? 10.0%，8 h降至7.4 ? 3.3 %，表明蛋白药物皮下吸收比较缓慢。
组织TCA可沉淀125I-放射性分布特点是：靶器官骨髓浓度较高，除甲状腺外，泌尿排泄系统浓度最高，血清、肝、脾及肺其次，脑内浓度最低。按AUC由低到高排列依次为脑、脂肪、肌肉、胸腺、肠内粪、生殖腺、淋巴结、小肠壁、肠内容、膀胱、心脏、胆囊、肾上腺、肺、脾、血清、骨髓、肝、肾和尿。多数组织在药后3 h浓度达到高峰。
酸可沉淀放射性与总放射性的比值可大致反映组织对125I-rhIL-11降解代谢的强弱程度，尿、胆囊及粪中比值较低，表明这些组织或体液中的放射性主要是小分子125I-降解物。
尿肾肝骨髓血清脾肺肾上腺胆囊心脏淋巴结肠内容小肠壁膀胱生殖腺*************吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Fig6 小鼠s.c.125I-rhIL-11后1.5h不同组织酸沉淀放射性按浓度高低排列的分布 均数?标准差，n=6，*,**和***：与血清比较，Student’s t 检验 P<0.05, P<0.01和 P<0.001。
Ｔａｂ５ 小鼠s.c.125I-rhIL-11 18.4 kBq后不同时间 各组织总放射性分布（Bq/gm组织湿重）
AUC
20 min 1.5h 3h 8h (Bq.h/组织
g) 232 体重(克) 20.9?1.4 20.2?0.5 20.4?1.5 20.8?1.4
360 脑 24.8?13.2*** 30.9?27.1*** 30.1?7.9*** 29.8?15.2
629 脂 肪 40.7?7.8*** 60.7?74.7*** 51.5?24.8*** 32.2?16.4**
肌 肉 72.7?73.8*** 94.4?100.5*** 67.9?7.8*** 91.4?70.8** 2142 心 脏 155.9?25.9** 319.6?147.6* 344.9?61.5** 191.1?114.0 2296 胸 腺 147.8?31.5*** 222.5?80.2*** 411.6?154.9 220.1?120.4 2319 生殖腺 125.9?93.7*** 251.6?111.7** 403.8?173.2 230.5?157.2* 2455 肠内粪 66.7?24.1*** 76.2?31.2*** 332.9?212.2* 488.5?169.6 2509 肺 224.5?38.1** 352.9?105.4* 393.5?145.3* 236.6?152.2 2539 淋巴结 182.4?61.3*** 355.4?269.9 463.6?251.9 168.7?158.8 2750 脾 322.4?185.8 383.1?99.4* 451.5?194.2 211.9?129.7 3016 肾上腺 225.9?111.0*388.4?156.5 510.1?177.4 268.2?205.5*** 3316
*
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
肠内容 302.0?123.1* 306.2?76.7*** 小肠壁 247.7?67.0** 437.9?170.0 血清
466.7?117.3 504.9?62.9
(Bq/mL)
膀 胱 262.1?131.0* 621.7?832.0 胆 囊 438.8?242.3 496.8?175.7 骨 髓 286.7?192.0 810.9?511.1 肝 522.1?191.6 671.5?45.0*** 肾 1234.6?366.22030.9?596.3*
*** ? 尿 13859.9? 34983.37474.2 7854.2*** (Bq/mL)
甲状腺% 0.3?0.1 1.2?0.4 注射部位52.9?10.0
42.5?11.9
%
554.6?126.0 566.2?149.8
351.3?187.7 381.2?321.2
3563 3961
595.7?154.9 400.5?166.2
4012 4135 4170 5077 11613 222723
587.4?188.4 431.0?334.5 748.2?324.5 284.5?223.5 683.3?392.2 261.1?80.7 993.5?941.1 224.5?113.5 1637.3?590.2*1063.1?222.3**
** ? 28001.6? 29871.212293.7** 17165.6** 1.7?0.5 3.3?1.5
29.9?4.7 7.4?3.3
*
，**和***：与同时间点血清比较，Student’s t-检验 P<0.05，P<0.01和
P<0.001。
Ｔａｂ６ 小鼠s.c.125I-rhIL-11 18.4 kBq后不同时间各组织
TCA可沉淀放射性分布（Bq/gm湿重）
AUC
20 min 1.5h 3h 8h (Bq.h/g) 组织
111 脑 13?9*** 14?12*** 11.9?4.0*** 15.6?4.0***
265 脂 肪 31?10*** 43?62*** 29.4?9.7*** 17.9?9.8***
399 肌 肉 47?41*** 52?44*** 45.4?20.4*** 50.1?75.0**
453 155.1?160.5 49.5?21.5*** 胸 腺 50?19*** 64?26***
486 肠内粪 19?19*** 20?7*** 99.1?72.8** 151.9?56.0
494 生殖腺 55?40*** 74?24*** 135.1?55.0** 45.8?12.2***
755 淋巴结 81?34*** 135?69* 124.4?65.6** 30.6?27.4***
787 小肠壁 85?18*** 114?55** 185.7?104.8 80.4?67.7**
880 肠内容 106?27*** 128?74* 226.9?79.7 85.6?60.7**
891 膀 胱 93?71** 101?119* 164.6?70.7* 143.6?187.2
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
906 心 脏 69?15*** 147?83 155.9?31.0* 72.5?36.9***
980 胆 囊 174?110 153?96 209.6?79.1 59.5?42.2***
肾上腺 110?43*** 165?181 148.7?74.1* 68.4?38.3*** 1011 肺 128?21** 165?73 166.0?69.0* 71.8?41.8*** 1033 脾 199?177 167?40 184.0?90.7 55.3?40.9*** 1055
1726 血清231?48 229?59 283.9?94.8 200.5?51.8
(Bq/mL)
骨 髓 170?132 313?135 424.5?317.3 103.0?55.3** 1820
2807 肝 399?158* 467?136** 754.0?762.2 146.4?107.3
肾 777?178*** 1045?422** 869.3?119.5*** 388.9?56.1** 6347 尿1603?664 4956?2669** 3547.1?1618.6*4326.3?2508.834733
**
(Bq/mL)
*，**和***：与同时间点血清比较，Student’s t-检验 P<0.05，P<0.01和P<0.001。
125
Ｔａｂ７ 小鼠s.c. I-rhIL-11 18.4 kBq后不同时间 各组织总放射性与TCA可沉淀放射性比值
20 min 1.5 h 3 h 8 h 组织 尿
膀胱 胆囊 小肠壁 肠内粪 胸腺 淋巴结 肾上腺 肠内容 生殖腺 脾 肺
0.12?0.01*** 0.34?0.12* 0.38?0.09* 0.36?0.12* 0.28?0.19* 0.34?0.07** 0.44?0.08 0.56?0.23 0.39?0.14 0.51?0.19 0.57?0.16 0.57?0.08
0.14?0.05*** 0.19?0.06*** 0.28?0.13* 0.26?0.07** 0.27?0.04** 0.34?0.21 0.43?0.17 0.36?0.21 0.43?0.26 0.34?0.17 0.45?0.07 0.46?0.09
0.13?0.04*** 0.28?0.08** 0.29?0.07** 0.31?0.10* 0.30?0.05** 0.32?0.18 0.27?0.03*** 0.29?0.08** 0.41?0.09 0.35?0.09* 0.40?0.07 0.41?0.09
0.13?0.03** 0.24?0.16* 0.20?0.08** 0.23?0.07** 0.29?0.07* 0.23?0.07** 0.23?0.10** 0.33?0.24 0.23?0.06** 0.31?0.14* 0.25?0.05** 0.33?0.08*
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
心脏 血清 脑 肾 骨髓 肌肉 脂肪 肝 甲状腺
*
0.45?0.11 0.50?0.07 0.52?0.17 0.64?0.08** 0.59?0.19 0.61?0.25 0.74?0.13** 0.75?0.15** 0.83?0.04*** 0.45?0.04 0.46?0.10 0.45?0.29 0.51?0.06 0.44?0.17 0.59?0.18 0.67?0.25 0.70?0.22* 0.90?0.04*** 0.45?0.03 0.47?0.07 0.42?0.21 0.57?0.13 0.61?0.20 0.67?0.30 0.64?0.23 0.74?0.04*** 0.91?0.04*** 0.37?0.12 0.52?0.16 0.59?0.23 0.35?0.06* 0.38?0.17 0.45?0.27 0.63?0.20 0.56?0.13 0.95?0.07***
，**和***：与同时间点血清比较，Student’s t-检验 P<0.05，P<0.01和P<0.001。
３．４ 小鼠皮下注射
125
I-rhIL-11后放射性的排泄
小鼠s.c.125I-rhIL-11后放射性主要经尿排泄，少量经粪排泄。24 h
尿排出注入放射性的75.7 ? 3.2 %，72 h尿和粪共排出放射性为92.3 ? 5.2 %(Tab8，Fig7)。尿SHPLC分析表明为125I-rhIL-11降解代谢物（Tab9）。72 h甲状腺残留注入放射性的1.5 ? 0.6%，注射部位仅残留0.4 ? 0.1 %。
Ｔａｂ８ 小鼠s.c.125I-rhIL-11后尿和粪中放射性的累计排泄
（占注入总放射性的%）
累计时间 h 尿排泄 % 粪排泄 % 尿+粪排泄 %
~8 52.9 ? 8.4 1.8 ?1.1 54.7 ? 8.3 ~24 75.7 ? 3.2 9.8 ? 2.7 85.5 ? 4.9 ~32 77.7 ? 3.1 10.4 ? 2.7 88.2 ? 4.9 ~48 79.3 ? 3.3 11.3 ? 2.9 90.6 ? 5.2 ~72 80.2 ? 3.3 12.0 ? 2.9 92.3 ? 5.2
100排出放射性（％）80604020 尿 粪 尿＋粪吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ７ 小鼠s.c.125I-rhIL-11后尿和粪中的排泄
均数 ? 标准差，n = 6
３．５ 125I-rhIL-11在体内外与血清蛋白的结合及体内降解
125
I-rhIL-11在体外加入正常小鼠血清后部分与血清蛋白结合, SHPLC
分析除洗脱体积为10.8mL的游离原形125I- rhIL-11峰外，还出现了洗脱体积为6.0 mL的大分子结合物峰(Fig8），平均结合率为39.4%?5.2%(33.8～44.1%，Tab9)。
50放射性（％） 403020100051015 标准１２５Ｉ－ｒｈＩＬ－１１ 鼠血清体外加 １２５Ｉ－ｒｈＩＬ－１１
2025303540洗脱体积（ｍＬ）吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ８ 125I-rhIL-11体外加入正常小鼠血清后SHPLC分析图谱 HP1100四元泵，TSK-GEL G3000WXL分子排阻柱，300×7.8 mm，洗脱液：0.01 mol.L-1磷酸缓冲液，含0.5 mol.L-1NaCl，pH7.0，流速1.0 mL.min-1。分部收集洗脱液， Wallac 1470 ?计数仪测定?放射性。标准125
I- rhIL-11的洗脱体积为10.8mL，加入小鼠血清后出现了洗脱体积为6.0mL的125I-标记大分子结合物峰。
Ｔａｂ９ 不同量125I-rhIL-11与血清蛋白的结合（%）
125I-rhIL-11(pg) 结合型 非结合型
3.0 44.1 ? 9.9 55.9 ? 9.9 16.5 40.4 ? 8.0 59.6 ?8.0 53.2 33.8 ? 6.8 66.2 ? 6.8 平均 39.4 ? 5.2 60.6 ? 5.2
小鼠皮下注射125I-rhIL-11(200 ?g.kg-1或18.4 KBq/鼠)后20 min，血清SHPLC分析出现三个放射性峰，分别是洗脱体积为6.0 mL的125I-标记大分子结合物峰、洗脱体积为10.8 mL的游离原形125I-rhIL-11峰和洗脱体积为14.0 mL的125I-标记小分子降解物峰，尿SHPLC分析有洗脱体积为11.6 mL的125I-rhIL-11代谢物峰和洗脱体积为14.0 mL的125I-小分子降解物峰，但未见125I-大分子结合物峰（Fig9）。
5040放射性（％） 标准１２５Ｉ－ｒｈＩＬ－１１ 药后２０ｍｉｎ血 药后２０ｍｉｎ尿302010005101520253035吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
Ｆｉｇ９ 小鼠s.c.125I-rhIL-11(200 ?g.kg-1或18.4 KBq/鼠）
后20min血清和尿样品的SHPLC图谱
HPLC条件同Fig5。显示血清出现三个放射性峰，分别是洗脱体积为6.0mL的125I-标记大分子结合物峰、洗脱体积为10.8mL的游离原形125I-rhIL-11峰和洗脱体积为14.0 mL的125I-标记小分子降解物峰，尿中有洗脱体积为11.6 mL125I-rhIL-11代谢物峰和洗脱体积为14.0 mL的125I-标记小分子降解物两个峰。
讨 论
药代动力学研究是新药研究的必须研究项目，我国和国外的新药指导原则都明确地指出了新药的药代动力学研究的技术要求。[21]药物代谢研究在发展新药研究中起三方面的作用：（1）研究新药的吸收、分布、代谢转化及排泄情况，以了解药物的安全性和为临床合理用药提供依据；（2）利用药物代谢研究数据去开发更有效的新药；（3）利用药物代谢研究数据去开发更安全的新药。
在新药发展研究中理想的情况是：（1）治疗目标明确：（2）有足够的化合物可提供筛选之用；（3）体外实验（如酶抑制或激活，受体结合）结果有效；（4）体内实验（如实验动物模型）有效；（5）毒性实
吉林大学硕士研究生论文 重组人白细胞介素１１的动物药代动力学研究
验安全；（6）临床试用有效，无严重毒副反应。通过上述6个关口，一个新药便诞生了。
有时新药开发研究不如人意，体外实验有效，体内实验无效。通常一般就放弃不继续研究，但从药物代谢考虑，体内实验无效可能由于：（1）生物利用度差；（2）药物代谢太快；（3）其它未知的原因。可能解决的办法是进行生物利用度研究，结果可能会出现两种情况：血药浓度低，这或是由于吸收差或代谢太快。为弄清楚此问题，需要将所研究的化合物用同位素标记作进一步的生物利用度实验。另一种情况是血药浓度高，而体内实验无效的原因或许由于化合物与血浆蛋白结合太强，或由于其它的原因。
归纳起来，在新药研究中经常涉及药物代谢研究中出现的问题：（1）如果药物吸收差，可考虑改进剂型；（2）如果是代谢太快，可考虑进行体内和体外实验，比较其代谢差异，了解其代谢的途径；如果毒性与生物活性可以分开，则改造化学结构合成新衍生物以减慢或阻断其代谢来降低毒性。如果毒性和生物活性分不开，只有终止该项研究；（3）如果血浆蛋白结合太强，可考虑修饰化学结构，合成新的衍生物，以降低其与蛋白的结合率；（4）如果出现了不明的原因，问题便难解决，只好放弃，开始新的研究计划。以上几方面的分析反映药物代谢研究在新药开发中的地位和意义，问题不一定均能解决，但它提供了解决问题的思路。[22]
蛋白质多肽药物尤其是基因重组生物因子产品的医学应用，是90年代国内外关注的课题和研究动向。我国对生物高新技术产品的医学应用极为重视，许多生物因子研究已列入国家863计划，当前面临基础研究转向临床应用的新阶段。各因子相继进入临床前评价，临床试验或临床应用阶段，为了正确评价各种重组生物因子在人体种的疗效和安全，必
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须研究生物因子在动物和人体内的药代动力学，吸收、分布、代谢和排泄的规律，这是解释生物因子 的生理学，药效学和毒理学，正确合理地进行临床试验必不可少的重要资料。[23-26]
查阅GENBANK表明人、猴和小鼠IL-11氨基酸序列比较，IL-11全长199个氨基酸，食蟹猴 (Macaca fascicularis) 与人（Homo sapiens) 同源性比较相差8个氨基酸，同源性96%；小鼠(Mus musculus)与人相差23个氨基酸，同源性88.4%。从药效学实验表明在rhIL-11在猕猴和C57小鼠都有效。首先开发本品的Genetic Institute向FDA申报资料选择猴和大鼠为动物模型。因此本实验选择猴为主要动物进行不同剂量和途径(静脉和皮下)的药代动力学和生物利用度研究，单次和多次皮下注射药物的药代动力学比较研究。选择C57小鼠进行药物体内分布，排泄，血浆蛋白结合，和代谢降解研究。
药代动力学研究的前提是建立可靠的测定方法，优良方法的主要标志是：特异性高，灵敏度高，重现性好，回收率高，线形范围宽。生物体液中活性蛋白质多肽的测定比化学药物更困难，因为蛋白质多肽与内源目标蛋白质结构相似，由相同氨基酸组成，微量被测定 蛋白质存在于大量各种内源性多肽蛋白质中，如何专一地识别目标多肽蛋白质又不受其他组分干扰是主要难题，鉴别蛋白质多肽和它的代谢物或降解物也有困难。其次是活性蛋白质多肽的给药量极低，一般为微克水平，体内浓度极低，要求高灵敏度测定方法。
免疫分析法的原理是利用直接针对被分析蛋白质多肽上的不同抗原决定簇部位的单克隆抗体或多克隆抗体特异性地识别被检测的目标蛋白质。它是一种迅速、灵敏、经济和适于批处理的方法，已被认为是蛋白质药代动力学研究的“备选方法”。包括酶联免疫吸附分析法（ELISA），放射免疫分析法（RIA）和免疫放射定量法（IRMA）。本
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实验使用的ELISA法已经成为最常用的免疫分析法，主要因为它灵敏，不用同位素，很大程度自动化而且可批处理。IL-11检测灵敏度达到12.5pg/mL，每块酶标板可检测40份血清样品。与生物检定法比较，免疫分析法特异性更好而且更容易操作，观察终点也更客观。缺点是对被分析蛋白质多肽不可能给出阳性的确定，如确切的生化组成和序列；或许不能鉴别蛋白质的活性形式与无活性形式；蛋白质部分降解后也有可能使蛋白质与抗体相互作用发生变化甚至使之消失。此外，这种方法不能同时测定代谢产物，代谢产物的存在也可能干扰测定；还可能受内源性物质如血浆结合蛋白质，抗体生成等的干扰。
同位素示踪法与分子筛高效液相色谱法（SHPLS）结合。SHPLC是依据蛋白质分子量的大小进行过筛，样品分子量的对数与洗脱时间或分配系数KD成反比。优点是可以得到降解物或分子量信息，缺点是分辨率较低，小分子降解物保留时间拖得很长，峰形差，不适宜作代谢产物分析。本实验中， 125I-rhIL-11在体外加入正常小鼠血清后部分与血清蛋白结合, SHPLC分析除洗脱体积为10.8mL的游离原形
125
I- rhIL-11峰外，还
125
出现了洗脱体积为6.0 mL的大分子结合物峰。小鼠皮下注射I-rhIL-
11(200 ?g.kg-1或18.4 KBq/鼠)后20 min，血清SHPLC分析出现三个放射性峰，分别是洗脱体积为6.0 mL的为10.8 mL的游离原形
125
125
I-标记大分子结合物峰、洗脱体积
125
I-rhIL-11峰和洗脱体积为14.0 mL的
125
125
I-标记小
分子降解物峰，尿SHPLC分析有洗脱体积为11.6 mL的物峰和洗脱体积为14.0 mL的
I-rhIL-11代谢
I-小分子降解物峰，但未见125I-大分子结
合物峰。对小分子降解物峰或大分子结合物峰的定性分析目前还无法进行。
同位素示踪法与酸沉淀法（TCA）相结合。多数分子量较大的蛋白质多肽，在一定浓度的三氯醋酸中沉淀。借助此法也可将含标记蛋白质
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的血浆或尿样品分为酸沉淀和酸可溶部分，即含标记蛋白质的沉淀部分和降解代谢后生成的酸溶部分。这种方法简单、灵敏、重现性和精密度高，可以可靠地发现生物降解的程度。尿液TCA法分析中
125
I-rhIL-11占
总放射性的百分率明显低于血浆，表明血浆在通过肾小球和肾小管的过程中，部分
125
I-rhIL-11降解为
125
I标记的亲水性降解产物，提示肾脏是
生物降解的重要器官之一。
有效性实验表明由地奥公司提供的rhIL-11与R&D 公司生产的rhIL-11标准品的免疫学反应平行，而R&D公司rhIL-11标准品可以通过公式U.ml-1=0.011?IL-11pg.ml-1[R&D值]转换成WHO/NIBSC [92/788]统一单位。这暗示本实验结果可以用于与其他动物实验或临床试验结果进行比较。在50-400 ?g.kg-1的剂量范围内rhIL-11在猕猴中呈线性药代动力学特点。这个结果与Akira 等[27]在小鼠实验中利用结果一致。
由rhIL-11与我们最近报道[28]的另一种特异血小板增加因子重组人血小板生成素(rhTpo)所诱导的猕猴周边血小板计数增加作用不同。rhIL-11的剂量水平比rhTpo 高100倍，并且需要重复给予。而给予rhIL-11后血小板增高所需要的达最大反应时间和维持的时间比给予rhTpo某种程度上长一些。这些结果暗示两种血小板增高蛋白作用的靶细胞或作用位点不同。给予rhIL-11后，浓度-时间变化过程与血小板增高过程有明显的延迟。 这个现象暗示rhIL-11对巨核细胞的增加作用与复杂的细胞成熟及血小板释放过程有关。 在研究中，我们发现血清中rhIL-11的最大浓度Cmax 和其在体内维持的时间都不与血小板增高的程度直接相关， 而系统的暴露强度作为浓度和时间的参数更适宜描述药物的暴露水平。[29] 所以，
111
In-rhIL-11，ELISA以及MTT 法得到的
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我们研究了rhIL-11的系统暴露强度与血小板增高过程的关系，结果表明在指导临床试验的合理剂量方案时应同时考虑药物的适宜浓度和维持时间。但它们之间的精确功能关系需要将来进一步研究。 分布实验中，肾脏和尿中浓度最高，提示rhIL-11与其它蛋白多肽体内过程主要通过泌尿系统排泄的共性。效应靶器官骨髓中浓度高于血浆浓度，说明了IL-11作用于造血系统的特异性。脑中浓度很低表明不能透过血脑屏障。
20世纪新药研究集中在作用于细胞膜上的酶靶和受体靶，以信息的传递和阻断为目的，打细胞膜边缘战。而21世纪新药研究的热点则将是作用于细胞内的核靶和多糖靶，主要是细胞内基因的修饰与调控，打细胞核内战。新药研究的攻关病种和难点仍然是针对近年来严重威胁人类健康的病毒，肿瘤，心脑血管性疾病和老年病。21世纪的新药研究，先导化合物的设计将成为热点，计算机辅助药物设计系统与生物工程相结合，将会使21世纪的新药研究出现突飞猛进的发展。[30]
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