(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111748544 A(43)申请公布日 2020.10.09
(21)申请号 202010665840.5(22)申请日 2020.07.12
(71)申请人 广东溢多利生物科技股份有限公司
地址 519060 广东省珠海市南屏科技工业
园屏北一路8号(72)发明人 梁伟凡 李阳源 唐雪梅 容晓燕
邓智远 刘金山 邓敬阳 林影 (74)专利代理机构 北京法信智言知识产权代理
事务所(特殊普通合伙) 11737
代理人 刘静荣(51)Int.Cl.
C12N 9/52(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12N 15/57(2006.01)
(54)发明名称
一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法(57)摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法。本发明采用毕赤酵母表达系统进行溶葡萄球菌酶的分泌表达，实现溶葡萄球菌酶的大量表达，降低生产成本，溶葡萄球菌酶最高表达量达到6g/L，而且溶葡萄球菌酶分泌表达于发酵上清液中，不需要破碎细胞，只需简单过滤除去菌体，即可得到杂蛋白很少的溶葡萄球菌酶粗酶液，本发明制备得到的溶葡萄球菌酶样品，对葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
C12R 1/84(2006.01)
权利要求书1页 说明书9页序列表7页 附图3页
CN 111748544 ACN 111748544 A
权 利 要 求 书
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1.一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括在毕赤酵母中表达优化的溶葡萄球菌酶编码基因的步骤，其中，所述优化的溶葡萄球菌酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。
2.一种生物制备溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：在毕赤酵母中表达优化的溶葡萄球菌酶编码基因，其中，所述优化的溶葡萄球菌酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示；
分离发酵上清液中的溶葡萄球菌酶。
3.根据权利要求2所述的生物制备溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，通过一步离子交换或亲和层析分离纯化发酵上清液中的溶葡萄球菌酶。
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CN 111748544 A
说 明 书
一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法。背景技术
[0002]葡萄球菌感染是由葡萄球菌引起的感染。溶葡萄球菌酶(Lysosthaphin，EC 3.4.24.75)是一种肽链内切酶，可切断细胞壁肽聚糖中五甘氨酸肽桥结构，从而迅速裂解细菌。由于葡萄球菌细胞壁富含五甘氨酸肽桥结构，因此溶葡萄球菌酶对葡萄球菌的杀菌效果特别显著，尤其是对耐药金葡菌MRSA，对其他革兰氏阳性细菌也有一定抑菌作用。溶葡萄球菌酶通过水解细菌细胞壁使细菌不能正常生长，从而达到杀菌效果，这种独特的抑菌机制决定其不容易产生耐药性。
[0003]溶葡萄球菌酶由Staphylococcus simulans(模仿葡萄球菌)分泌表达，但天然来源的产量低，且本身属于致病菌，不适合工业发酵生产。随着基因工程技术的发展，已经实现了溶葡萄球菌酶在多个物种的重组表达。虽然溶葡萄球菌酶已经实现异源重组表达，并且表达量相对于天然宿主而言有了较大提高，但整体而言，溶葡萄球菌酶的表达水平仍然偏低，表达量不超过0.5g/L，工业化生产成本较高。
[0004]毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白表达系统之一，但是外源蛋白在宿主内表达翻译后的加工折叠过程难以预计，因此特定外源蛋白是否能在毕赤酵母表达系统中高效表达仍需克服难以预期的技术难题。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供高效表达溶葡萄球菌酶的方法。
[0006]本发明的再一目的是提供一种生物制备溶葡萄球菌酶的方法。[0007]根据本发明的高效表达溶葡萄球菌酶的方法，包括在毕赤酵母中表达优化的溶葡萄球菌酶编码基因的步骤，其中，所述优化的溶葡萄球菌酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。
[0008]根据本发明的生物制备溶葡萄球菌酶的方法，所述方法包括步骤：[0009]在毕赤酵母中表达优化的溶葡萄球菌酶编码基因，其中，所述优化的溶葡萄球菌酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示；[0010]分离发酵上清液中的溶葡萄球菌酶。
[0011]虽然溶葡萄球菌酶已经实现了异源重组表达，表达量较天然生产菌株有所提高，但目前的表达水平仍然较低，生产成本较高，为了解决这些问题，本发明采用毕赤酵母表达系统进行溶葡萄球菌酶的分泌表达，实现溶葡萄球菌酶的大量表达，降低生产成本。同时，本发明还提供一种溶葡萄球菌酶的生产方法和蛋白分离纯化方法。本发明所使用的毕赤酵母表达系统的溶葡萄球菌酶最高表达量达到6g/L，是公开报道的最高水平。而且溶葡萄球菌酶分泌表达于发酵上清液中，不需要破碎细胞，只需简单过滤除去菌体，即可得到杂蛋白很少的溶葡萄球菌酶粗酶液，仅需一步离子交换或亲和层析即可获得高纯度的溶葡萄球菌
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说 明 书
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酶纯化样品，降低蛋白分离纯化成本。本发明制备得到的溶葡萄球菌酶样品，对葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
附图说明
[0012]图1显示Top10/pPICzαA-Lss菌落PCR电泳验证结果，其中，M：标准核酸分子量标记；1-6：Top10/pPICzαA-Lss菌落PCR验证条带；[0013]图2显示发酵上清液抑菌圈检测结果，其中，1：优化序列1发酵上清液，2：优化序列2发酵上清液，3：优化序列3发酵上清液，4：原始序列发酵上清液，5：发酵罐发酵40h，上清液原液，6：发酵罐发酵110h，上清液稀释5倍，7：发酵罐发酵180h，上清液稀释10倍；[0014]图3为溶葡萄球菌酶发酵曲线；
[0015]图4显示溶葡萄球菌酶蛋白电泳结果；[0016]图5显示溶葡萄球菌酶耐热评估结果，其中，1：50℃，2：60℃，3：70℃，4： 80℃，5：90℃，6：100℃。具体实施方式
[0017]下列实施例中未注明具体条件的实验操作，均参照《分子克隆实验指南》 (Molecμlar Cloning：A Laboratory Manual，2002)中所述的条件进行，或按照试剂盒和说明书进行。DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶购于New England Biolabs 公司，X33毕赤酵母及其表达载体购于Invitrogen公司。其他材料如无特殊说明，均可从商业途径获得。[0018]实施例1溶葡萄球菌酶表达菌株的构建[0019]从NCBI数据库获得Staphylococcus simulans(模仿葡萄球菌)的溶葡萄球菌酶氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示。根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性 (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4922)对溶葡萄球菌酶的成熟区(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因序列如SEQ ID NO.11所示)进行密码子优化，并在基因序列末端添加终止密码子TAA，获得成熟的溶葡萄球菌酶基因序列，密码子优化的基因序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13所示。[0020]溶葡萄球菌酶氨基酸，SEQ ID NO.1
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说 明 书
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[0021]
[0022]
溶葡萄球菌酶的成熟区，SEQ ID NO.2
[0023]
[0024]
密码子优化的基因序列：SEQ ID NO.3
[0025]
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说 明 书
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[0026]
[0027]
SEQ ID NO.12
[0028]
[0029]
SEQ ID NO.13
[0030]
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说 明 书
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[0031]
以优化基因序列SEQ ID NO.3为例介绍载体构建，其他基因序列按相同方法构建
即可。以合成基因为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增溶葡萄球菌酶基因，在上游引物5’端添加EcoRI酶切位点(GAATTC)，在下游引物5’端添加SalI酶切位点(GTCGAC)，扩增两端含酶切位点的溶葡萄球菌酶成熟基因，引物信息如下：[0033]上游引物：5’-GCTGAATTCGCTGCTACTCACGAACACTC-3’(SEQ ID NO.4)[0034]下游引物：5’-ATGGTCGACTTACTTGATAGTACCCCACA-3’(SEQ ID NO.5)[0035]扩增溶葡萄球菌酶目的基因条带约0.75kb，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，按基因回收试剂盒说明书纯化回收目的基因，用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切溶葡萄球菌酶基因，于37℃培养箱酶切2h，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，按基因回收试剂盒说明书纯化回收酶切后的溶葡萄球菌酶基因。酶切后的溶葡萄球菌酶基因与同样经过限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切的毕赤酵母表达载体pPICzαA进行连接反应，T4DNA连接酶于16℃过夜反应。连接产物通过热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含100μg/mL博来霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养至长出单菌落。利用pPICzαA载体的通用引物(5AOX和3AOX)进行菌落PCR验证阳性转化子，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，目的条带约1.2kb，验证结果如图1所示。[0036]5AOX：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’(SEQ ID NO.6)[0037]3AOX：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.7)[0038]阳性转化子送去测序，所得即为成熟溶葡萄球菌酶的毕赤酵母表达载体 pPICzαA-Lss-1。该表达载体中溶葡萄球菌酶的表达受毕赤酵母最强的启动子AOX1 转录调控，同时含有α-信号肽可以保证蛋白的正常分泌至细胞外，在α-信号肽和溶葡萄球菌酶之间含有Kex2切割位点，保证表达的融合蛋白能被正确切割去除信号肽。以甲醇作为诱导剂诱导表达α-信号肽和溶葡萄球菌酶融合蛋白，融合蛋白在N端α-信号肽的引导下转运至内质网，进而在高尔基体内被Kex2蛋白酶切割去除α-信号肽，从而释放出天然的成熟溶葡萄球菌酶，
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[0032]
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说 明 书
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最终分泌至细胞外。
[0039]为了方便溶葡萄球菌酶的分离纯化，可在溶葡萄球菌酶添加His标签，通过His 标签可利用Ni-NTA亲和层析纯化溶葡萄球菌酶。pPICzαA载体的多克隆位点后面含有His标签，设计表达载体时只需把溶葡萄球菌酶基因插入多克隆位点，并把终止密码子(TAA)去除，直接与载体上的His标签融合表达，利用载体本身的终止密码子 (TGA)终止蛋白表达。与上述载体构建方法一样，同样选择多克隆位点上的EcoRI 和SalI酶切位点作为溶葡萄球菌酶基因插入位点。利用上游引物和His引物扩增去除终止子且带有酶切位点的成熟溶葡萄球菌酶基因，限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切 2h，再与同样经过限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切的pPICzαA载体连接，热激转化大肠杆菌，筛选阳性转化子，获得含His标签的成熟溶葡萄球菌酶表达载体 pPICzαA-LssHis。[0040]His引物：5’-ATGGTCGACCTTGATAGTACCCCACAAAA-3’(SEQ ID NO.8)[0041]含His标签的成熟溶葡萄球菌酶氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，对应的基因序列如SEQ ID NO.10所示。[0042]SEQ ID NO.9
[0043]
[0044][0045]
SEQ ID NO.10
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说 明 书
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[0046]
上述表达载体经限制性内切酶PmeI酶切2h，琼脂糖凝胶电泳回收线性化表达载
体，电转(1.5kv-2.5kv)至毕赤酵母感受态细胞，如X33、GS115、SMD1168、KM71 等，优选X33。菌液涂布于含博来霉素抗性的YPD平板，30℃培养3-5天，直至长出单菌落。挑取单菌落进行培养发酵，检测发酵上清液的溶葡萄球菌酶酶活，筛选获得最优表达菌株。[0048]以同样的方法构建优化基因序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13的重组表达载体，并转化毕赤酵母细胞，检测发酵上清液的溶葡萄球菌酶酶活，筛选获得最优表达菌株。[0049]实施例2重组溶葡萄球菌酶的表达与检测[0050]摇瓶培养：挑取实施例1中构建的溶葡萄球菌酶毕赤酵母表达菌株，接种于5mL YPD培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。按1％接种量接种于50mL BMGY培养基(250mL三角瓶)，30℃，220rpm培养24小时，4000Xg离心5min，收集菌体，50mL BMMY培养基重悬菌体，30℃，220rpm培养，每隔24小时添加 1％甲醇(终浓度)进行诱导，诱导3天，4000Xg离心5min，取上清液进行检测。[0051]发酵罐发酵：挑取实施例1中构建的溶葡萄球菌酶毕赤酵母表达菌株，接种于 25mL YPD培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备一级种子液。取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中制备二级种子液，30℃，220rpm培养24小时。二级种子液全部接种于5L发酵罐(2LBSM培养基)，控制温度30℃±0.5℃，溶氧 20％±5％，pH＝5.0±0.5。基础甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后直至溶氧突然上升至80％及以上，饥饿半小时，流加甲醇诱导溶葡萄球菌酶表达，诱导表达180-200 小时，不同时间点取样进行检测。[0052]溶葡萄球菌酶抑菌活性检测：采用抑菌圈评估抑菌活性。将指示菌金黄色葡萄球菌CMCC26003接种于LB培养基，37℃，220rpm过夜培养，制备指示菌液。用生理盐水稀释至OD625＝2.3，取100μL稀释指示菌液至100mL LB固体培养基(温度 50-55℃)，混匀，取10.5mL
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[0047]
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固体培养基至标准培养皿，冷却凝固。利用打孔器打孔，每孔添加5μL发酵上清液，盖上陶瓦盖，置于37℃培养箱培养16小时，观察抑菌圈结果。溶葡萄球菌酶的原始序列和3个优化序列菌种的摇瓶培养发酵液的检测结果如图2所示，结果显示这4个菌种均有抑菌活性，且3个优化序列菌种的抑菌圈比原始序列的抑菌圈大，说明经密码子优化后，溶葡萄球菌酶的表达量显著提高，抑菌活性也得到了提高。3个优化序列中溶葡萄球菌酶表达水平最好的是优化序列1，即SEQ ID NO.3，该基因序列GC含量从52.5％降低至44.4％，密码子适应性指数 (CAI)从0.819提高到0.972，更适合毕赤酵母重组表达。另外，融合His纯化标签的溶葡萄球菌酶液也具有很好的抑菌活性，与未融合表达的溶葡萄球菌酶抑菌活性相当。[0053]发酵罐发酵液抑菌检测结果如图2所示。表达SEQ ID NO.3基因序列的菌种发酵时间越长，表达的溶葡萄球菌酶越多，形成的抑菌圈越大。在发酵180小时，发酵液稀释10倍，依然具有很明显的抑菌活性。利用毕赤酵母表达的溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌具有很好的杀菌效果。
[0054]蛋白浓度检测：采用Bradford法测定发酵上清液总蛋白浓度。发酵罐发酵的溶葡萄球菌酶表达曲线如图3所示，最高表达量达到6g/L，是目前报道的最高表达水平。[0055]蛋白电泳(SDS-PAGE)：采用金斯瑞公司的蛋白电泳预制胶进行溶葡萄球菌酶的蛋白电泳，结果如图4所示。在26-34kDa标准分子量之间有目标大小的蛋白条带，条带大小与成熟的溶葡萄球菌酶分子量相近，约26.9kDa。通过软件分析，发酵液中溶葡萄球菌酶的含量70％以上，杂蛋白含量非常少，有利于蛋白的分离纯化。[0056]实施例3稳定性评价
[0057]通过连续传代培养评价菌株稳定性。挑取实施例1中所构建的表达溶葡萄球菌酶的毕赤酵母细胞菌落接种于3mL YPD培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5mL种子液接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50mL离心管中，离心(4000×g，室温)弃上清，用25mL甲醇浓度为1％的BMMY培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30℃，220rpm 培养72小时，每24小时添加甲醇至1％浓度。离心(4000×g，室温)取发酵上清液进行抑菌圈检测和蛋白浓度检测。挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液抑菌圈，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的抑菌圈大小几乎一样，蛋白浓度都在在0.3-0.4g/L之间，说明菌株稳定性良好。[0058]耐热稳定性：取适量发酵上清液，于水浴锅中加热处理5min，处理温度分别是 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃，观察热处理后的发酵液仍然是澄清，说明溶葡萄球菌酶并没有遇热而发生变性沉淀。4000Xg离心5min，取上清液进行抑菌圈检测，结果如图5所示。溶葡萄球菌酶能耐受70℃，抑菌活性保持不变，同时在100℃处理仍然具有一定抑菌活性，说明溶葡萄球菌酶具有良好的热稳定性，特别适用于饲料制粒过程需要高温条件的饲料行业。
[0059]实施例4重组溶葡萄球菌酶的分离纯化[0060]收集实施例2中的发酵上清液，使用卷式膜脱盐，多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm。脱盐液用0.45um滤膜过滤，收集过滤脱盐液。用10倍柱床体积的结合缓冲液平衡CM-Sepharose Fast Flow层析柱，流速为1倍柱床体积/min。将过滤脱盐液上柱，流速为1倍柱床体积/min。5倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。使用5倍柱床体积的0.3M洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为1倍柱床体积/min。使用5倍柱床体积的0.5M洗脱液
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说 明 书
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洗涤层析柱，洗脱目的蛋白，流速为1倍柱床体积/min。洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。该洗脱液即为溶葡萄球菌酶洗脱液。使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子强度小于1ms/cm，所得即为重组溶葡萄球菌酶纯化样品。纯化蛋白的蛋白电泳结果如图4所示，只有单一的目的条带，几乎没有杂蛋白。毕赤酵母发酵采用的是无机盐培养基，蛋白杂质少，并且毕赤酵母本身分泌的杂蛋白很少，所得发酵上清液中溶葡萄球菌酶含量高，杂蛋白含量少，因此只需一步离子交换即可得到高纯度的纯化蛋白样品。
[0061]结合缓冲液：3.8mM NaH2PO4，16.2mM Na2HPO4，50mM NaCl。0.3M洗脱液： 3.8mM NaH2PO4，16.2mM Na2HPO4，0.3M NaCl。0.5M洗脱液：3.8mM NaH2PO4，16.2mM Na2HPO4，0.5M NaCl。上述洗脱液，溶解后通过0.22μm过滤膜过滤。[0062]若表达含His标签的溶葡萄球菌酶融合蛋白，可以使用Ni-NTA亲和层析方法特异性纯化回收溶葡萄球菌酶。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA层析柱，流速为1倍柱床体积/min。发酵上清液可直接上柱进行蛋白纯化，流速为1倍柱床体积/min。5倍柱床体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，5倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱，洗脱杂质。使用5倍柱床体积的100-500mM洗脱液冲洗层析柱，洗脱目的蛋白，流速为1倍柱床体积/min。洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。该洗脱液即为溶葡萄球菌酶洗脱液。使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子强度小于1ms/cm，所得即为重组溶葡萄球菌酶纯化样品。[0063]平衡缓冲液：9.5mM NaH2PO4，40.5mM Na2HPO4，500mM NaCl，pH7.4。结合缓冲液：9.5mM NaH2PO4，40.5mM Na2HPO4，500mM NaCl，10mM咪唑，pH7.4。洗脱液：9.5mM NaH2PO4，40.5mM Na2HPO4，500mM NaCl，100-500mM咪唑，pH7.4。上述溶液溶解后通过0.22μm过滤膜过滤。
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序 列 表
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序列表<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司<120> 一种高效表达一种溶葡萄球菌酶的方法<160> 13<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 493<212> PRT<213> Staphylococcus simulans<400> 1Met Lys Lys Thr Lys Asn Asn Tyr Tyr Thr Arg Pro Leu Ala Ile Gly1 5 10 15Leu Ser Thr Phe Ala Leu Ala Ser Ile Val Tyr Gly Gly Ile Gln Asn 20 25 30Glu Thr His Ala Ser Glu Lys Ser Asn Met Asp Val Ser Lys Lys Val 35 40 45Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val 50 55 60Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser65 70 75 80Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro 85 90 95Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn 100 105 110Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu 115 120 125Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr 130 135 140Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala145 150 155 160Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu 165 170 175Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala 180 185 190Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu 195 200 205Thr Ser Lys Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys 210 215 220
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序 列 表
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Ala Pro Val Glu Asn Thr Ala Glu Val Glu Thr Ser Lys Ala Leu Val225 230 235 240Gln Asn Arg Thr Ala Leu Arg Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln 245 250 255Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu 260 265 270Gly Ile Asn Gly Gly Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile 275 280 285Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly 290 295 300Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp305 310 315 320Gly Val His Arg Gln Trp Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys 325 330 335Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser 340 345 350Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn 355 360 365Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser 370 375 380Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr385 390 395 400Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala 405 410 415Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe 420 425 430Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His 435 440 445Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr 450 455 460Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys465 470 475 480Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly Thr Ile Lys 485 490<210> 2<211> 246<212> PRT<213> Staphylococcus simulans(模仿葡萄球菌)<400> 2
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序 列 表
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Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys1 5 10 15Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His 20 25 30Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile 35 40 45Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly 50 55 60Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala 85 90 95Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro 100 105 110His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala 115 120 125Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly 130 135 140Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr145 150 155 160Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp 165 170 175Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly 180 185 190Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln 195 200 205Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile 210 215 220Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val225 230 235 240Leu Trp Gly Thr Ile Lys 245<210> 3<211> 741<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3gctgctactc acgaacactc tgctcaatgg ttgaacaact acaagaaggg ttacggttac 60ggtccatacc cattgggtat caacggtggt atgcactacg gtgttgactt cttcatgaac 120
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序 列 表
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atcggtactc cagttaaggc tatctcttct ggtaagatcg ttgaagctgg ttggtctaac 180tacggtggtg gtaaccaaat cggtttgatc gaaaacgacg gtgttcacag acaatggtac 240atgcacttgt ctaagtacaa cgttaaggtt ggtgactacg ttaaggctgg tcaaatcatc 300ggttggtctg gttctactgg ttactctact gctccacact tgcacttcca aagaatggtt 360aactctttct ctaactctac tgctcaagac ccaatgccat tcttgaagtc tgctggttac 420ggtaaggctg gtggtactgt tactccaact ccaaacactg gttggaagac taacaagtac 480ggtactttgt acaagtctga atctgcttct ttcactccaa acactgacat catcactaga 540actactggtc cattcagatc tatgccacaa tctggtgttt tgaaggctgg tcaaactatc 600cactacgacg aagttatgaa gcaagacggt cacgtttggg ttggttacac tggtaactct 660ggtcaaagaa tctacttgcc agttagaact tggaacaagt ctactaacac tttgggtgtt 720ttgtggggta ctatcaagta a 741<210> 4<211> 29<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4gctgaattcg ctgctactca cgaacactc 29<210> 5<211> 29<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5atggtcgact tacttgatag taccccaca 29<210> 6<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6gactggttcc aattgacaag c 21<210> 7<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7gcaaatggca ttctgacatc c 21<210> 8<211> 29<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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序 列 表
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<400> 8atggtcgacc ttgatagtac cccacaaaa 29<210> 9<211> 254<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys1 5 10 15Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His 20 25 30Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile 35 40 45Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly 50 55 60Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala 85 90 95Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro 100 105 110His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala 115 120 125Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly 130 135 140Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr145 150 155 160Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp 165 170 175Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly 180 185 190Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln 195 200 205Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile 210 215 220Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val225 230 235 240Leu Trp Gly Thr Ile Lys Val Asp His His His His His His 245 250
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<210> 10<211> 765<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10gctgctactc acgaacactc tgctcaatgg ttgaacaact acaagaaggg ttacggttac 60ggtccatacc cattgggtat caacggtggt atgcactacg gtgttgactt cttcatgaac 120atcggtactc cagttaaggc tatctcttct ggtaagatcg ttgaagctgg ttggtctaac 180tacggtggtg gtaaccaaat cggtttgatc gaaaacgacg gtgttcacag acaatggtac 240atgcacttgt ctaagtacaa cgttaaggtt ggtgactacg ttaaggctgg tcaaatcatc 300ggttggtctg gttctactgg ttactctact gctccacact tgcacttcca aagaatggtt 360aactctttct ctaactctac tgctcaagac ccaatgccat tcttgaagtc tgctggttac 420ggtaaggctg gtggtactgt tactccaact ccaaacactg gttggaagac taacaagtac 480ggtactttgt acaagtctga atctgcttct ttcactccaa acactgacat catcactaga 540actactggtc cattcagatc tatgccacaa tctggtgttt tgaaggctgg tcaaactatc 600cactacgacg aagttatgaa gcaagacggt cacgtttggg ttggttacac tggtaactct 660ggtcaaagaa tctacttgcc agttagaact tggaacaagt ctactaacac tttgggtgtt 720ttgtggggta ctatcaaggt cgaccatcat catcatcatc attga 765<210> 11<211> 741<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11gctgctaccc acgagcactc cgctcaatgg ttgaacaact acaagaaggg ttacggttac 60ggtccatacc cattgggtat caacggtggt atgcactacg gtgttgactt cttcatgaac 120atcggtaccc cagtcaaggc tatctcctcc ggtaagatcg tcgaggctgg ttggtccaac 180tacggtggtg gtaaccaaat cggtttgatc gagaacgacg gtgtccacag acaatggtac 240atgcacttgt ccaagtacaa cgtcaaggtc ggtgactacg tcaaggctgg tcaaatcatc 300ggttggtccg gttccaccgg ttactccacc gctccacact tgcacttcca aagaatggtc 360aactccttct ccaactccac cgctcaagac ccaatgccat tcttgaagtc cgctggttac 420ggtaaggctg gtggtaccgt caccccaacc ccaaacaccg gttggaagac caacaagtac 480ggtaccttgt acaagtccga gtccgcttcc ttcaccccaa acaccgacat catcaccaga 540accaccggtc cattcagatc catgccacaa tccggtgtct tgaaggctgg tcaaaccatc 600cactacgacg aggtcatgaa gcaagacggt cacgtctggg tcggttacac cggtaactcc 660ggtcaaagaa tctacttgcc agtcagaacc tggaacaagt ccaccaacac cttgggtgtc 720ttgtggggta ccatcaagta a 741<210> 12<211> 741<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12gctgccacac atgaacattc tgcacagtgg ttaaacaact ataaaaaagg ttatgggtac 60ggaccttacc ctctgggtat aaacggtgga atgcactatg gcgttgattt cttcatgaat 120attggtacgc cagttaaggc aatttcctcc ggtaaaatcg ttgaagctgg ttggtccaat 180tacggcggtg gtaaccaaat cggacttatt gaaaatgatg gggtccatcg tcagtggtac 240atgcatttat ctaaatataa tgttaaggtt ggtgattatg tcaaagctgg ccaaataatc 300gggtggtccg gaagtaccgg ttatagtaca gctccgcatt tacattttca aaggatggtt 360aacagcttct caaactccac tgctcaagat ccaatgccct tcttaaagtc agctggttat 420ggtaaggcgg gcggtaccgt tactcctaca cccaatacag gttggaaaac caataagtat 480ggaaccctgt acaaaagtga gagtgcatct ttcacaccca acaccgatat tattacacgt 540accaccggcc cttttagatc catgcctcag agtggggtat tgaaagccgg ccaaaccatt 600cattatgatg aagtcatgaa acaagatggt cacgtctggg ttggttatac tggtaatagt 660ggtcagcgta tttacctacc tgtaagaacc tggaacaagt ctaccaatac tttgggtgtg 720ctttggggca ccataaagta a 741<210> 13<211> 741<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13gctgctactc atgagcattc cgcccaatgg ctaaataatt acaaaaaggg ttatggttat 60gggccttatc ctctgggaat caatggaggt atgcactacg gtgtagactt cttcatgaat 120ataggcaccc cggtgaaggc catatcttca ggaaagattg ttgaagcggg gtggtccaat 180tacggaggtg gaaaccaaat agggttaatc gagaacgacg gtgttcatag gcagtggtat 240atgcacttaa gtaaatacaa cgtcaaggtc ggggattacg taaaggctgg ccagattata 300ggctggagtg gaagcacggg gtattctacg gcaccccatt tgcactttca acgaatggtc 360aacagcttta gtaactcgac agcgcaggac ccaatgccgt ttctaaaatc cgcaggttac 420ggcaaggcgg gcggcaccgt gactccaact ccgaacacag gatggaaaac caacaaatat 480gggacactct acaaatcaga gtcagcctcg tttactccca atacagacat tattacgaga 540accactggtc ccttccggtc tatgcctcaa agcggggtac ttaaggcagg acagacgatt 600cactatgatg aagttatgaa acaagatggc cacgtgtggg ttggttatac cggtaattct 660gggcagcgta tctacttgcc agtccgcacc tggaacaaat ctactaatac gctcggcgtg 720ctgtggggaa caatcaaatg a 741
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图5溶葡萄球菌酶耐热评估
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