水体中微囊藻毒素的监测与分析

水体中微囊藻毒素的监测与分析

随着水体富营养化状况的日益加剧，蓝藻水华爆发带来的微囊藻毒素污染成为一个全球关注的环境问题。微囊藻毒素（Microcystins, MCs）是由蓝藻产生的一种具有强烈致癌作用的肝毒素，其分子结构复杂、种类繁多，以痕量形式稳定存在于各类富营养化的天然水体中。有资料表明，饮用水中的微囊藻毒素污染可能是除黄曲霉毒素以外导致肝癌的另一个重要诱因，随着世界各国对微囊藻毒素的重视,中国也在相关水质标准中新增了微囊藻毒素这一指标,如今水环境中微囊藻毒素的监测与控制已变得非常重要。 一、 微囊藻毒素的简介 1. 微囊藻毒素的产生

一般认为MCs 为细胞内毒素，在藻类死亡、细胞破裂后从细胞内释放到环境中。但是，已有研究发现，藻类在死亡之前也会向水体中分泌毒素。关于MCs 的产生机制主要有两种观点：一种认为是由遗传学因素主导；另一种认为是环境因素主导。

2. 微囊藻毒素的结构

微囊藻毒素是由水体中蓝绿藻如铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、鱼腥藻（Anabaena spp.）、颤藻（Oscillatoriaruescens）等产生的具有生物活性的单环七肽化合物，其可表示为环（D－丙氨酸－L－X－赤－β－甲基－D－异天冬氨酸－L－Z－Adda－D－异谷氨酸－N－甲基脱氢丙氨酸）。其中，Adda（3－氨基－9－甲氧基－2，6，8－三甲基－10－苯基－4，6－二烯酸）是MCs 生物活性表达所必需的；X、Z为两个可变的氨基酸残基，这两个可变的L－氨基酸的更替及其它氨基酸的去甲基化，衍生出众多的毒素类型，至今已发现MCs有60多种变体。在众多变体中存在最普遍、含量较多、毒性较大、研究详细的是MC-RR、MC-LR，R、L分别代表精氨酸、亮氨酸。 3. 微囊藻毒素的性质

MCs的性质稳定，在水中为中性或带负电荷的分子集团，可溶于水（溶解度>1g/L），在水中的自然降解过程缓慢，仅有少量能被水体微粒吸附沉淀。纯化的MCs在阳光照射下稳定，但当其曝露于波长在其吸收峰周围的紫外线中，分子发生异构化，方可使MC-LR快速降解。MCs具有热稳定性，加热煮沸（水浴100℃，

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30min）不致丧失毒性。现行自来水处理工艺的混凝、沉淀、过滤等不能有效去除MCs。

MCs不同异构体稳定性不同，一般的MCs是稳定的，但也有的异构体相对不稳定，在室温下能被水解。由于毒素构型的变化使毒性的大小差异很大，如MC-LR的毒性大大高于MC-RR。在自然条件下，温度和光照对构型的变化似乎起着很重要的作用，如从不同季节、不同水域甚至同一水域采集到同种微囊藻毒株的毒性表现出很大差异。

MCs会给动植物的生长、发育以及生存带来严重的破坏，饮用水中的微囊藻毒素会严重威胁人类的健康。水体中含一定浓度的MCs可导致鱼卵变形，蚤类死亡，鱼类行为和生长异常甚至死亡；泥鳅卵发育阶段对MC-LR最敏感，主要表现为心脏发育异常、小头和身体弯曲，并发现心脏和肝是MC-LR的主要攻击目标。研究MCs对藻类、微生物和真菌生长的效应发现：初始50mg·L-1的MCs可完全抑制灰色念珠藻和鱼腥藻的生长，使细胞溶解，并抑制二氧化碳的吸收和光合作用的效应，这也是铜绿微囊藻利用MCs的杀藻作用使其在自然条件下保持为优势藻种的重要原因有学者发现如果给贻贝投喂含MCs的蓝藻可导致其死亡，在贝类组织中检测到了游离和结合态的MCs，并推测MCs主要与蛋白磷酸酶进行结合；有人[8]也从咸水湖的罗非鱼中检测到了MC的存在，并发现MC在鱼肉组织中的含量已接近或高于饮用水MC（MC-LR）标准1 μg·L-1的水平。另外，饮用水中痕量MCs的存在促进人类肿瘤形成的现象也不容忽视。

为了确保饮用水的安全健康，1998年国际卫生组织（WHO）出版的《饮用水卫生基准》制定了微囊藻毒素的饮用水标准，推荐源水中LR的标准为1 μg·L-1，我国卫生部也在2001年颁布的《生活饮用水卫生规范》中推荐饮用水源水中微囊藻毒素含量标准，与WHO相同。 二、 水体中微囊藻毒素的监测

微囊藻毒素是目前已知的一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类，因此建立健全对湖泊、河流、水库、饮用水源水体中微囊藻毒素的监测监控方法至关重要。在20世纪80年代对全国范围内的水源水质进行过全面的调查，结果表明34个湖泊中有一半以上的湖泊面积处于富营养状态。进入20世纪90年代，全国淡水水体富营养化日益严重，涉及范围不断扩

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大。通过对各大饮用水水源及各种湖泊的监测表明，在夏秋季节藻类水华严重，每年长达7～8个月，而天然水体蓝藻水华80%是产生毒素的。从加拿大、日本、芬兰、美国、中国等地对湖水、河水、水库水、井水及自来水等水样的检测结果看，有的水体中微囊藻毒素检出率高达60%～87%，淡水水源受到微囊藻毒素的检测方法的研究日益深入，需要建立一种简单、快速、准确的系统的监测及检测方法。

三、微囊藻毒素的检测与分析

微囊藻毒素的检测，国内外学者在这方面做了大量研究工作，建立了多种检测方法。主要检测方法有高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱（LC-MS）、薄层色谱法（LC）、酶联免疫分析（ELISA）、MMPB法等。其中，最常用的是HPLC、LC-MS和ELISA。

生物法是最早采用的常规毒性分析法，通常采用动物口服或注射来间接衡量藻毒素的毒性，毒性强弱用半致死量（LD50）来衡量。

HPLC法是WHO、英美等发达国家和我国权威机构推荐的MCs检测方法。大多数实验室也是用配有二极管阵列检测器的反相高效液相色谱（HPLC-PDA）来进行MCs的常规检测。近年来，HPLC测定MCs的报道很多，基本都集中在对样品的前处理、洗脱液、SPE柱、淋洗剂、浓缩定容过程、色谱分析条件的优化等方面。HPLC测微囊藻毒素的前处理以固相萃取为主，一般采用C18或HLB柱为填料的反相柱。目前，广泛采用的高效液相色谱-紫外联机法（HPLC-UV）对毒素进行萃取分离并纯化后进行紫外检测，通过被测毒素与标准毒素出峰时间的比较对毒素种类进行定性鉴定，并用峰面积比较法对毒素进行定量分析，检测限一般为10-9级。Sano等将MCs中Adda上的碳碳双键氧化断裂后得到2-甲基-3-甲氧基-4-苯丁酸（MMPB），对MMPB进行荧光衍生后用HPLC-FL法进行检测，检测限为10-12级。

GC-MS也是用于MCs总量测定的一种方法，检测限一般为10-9级，它具有快速、准确、灵敏地对痕量MCs定量的优点，并且能通过准确的分子量及结构信息确定毒素类型和MCs的不同异构体，并可以分析测定后出现的峰值，从而得到每一种异构体的量。

薄层色谱法（TLC）由于设备要求低，操作简单、方便、快速，有较好的灵敏度，在MCs分离、分析中有较好的应用前景，检测限约10 ng MC-LR，可以和免

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疫学方法、蛋白磷酸酶法配合使用。但由于水中存在较多干扰物，其实际应用还有待进一步研究。Pel-ander等用TCL测MC时使用N，N-二甲基-1，4-苯二胺二氯化物（N，N-DPDD），该法检测限达到1.0 μg•L-1的标准。

毛细管电泳法（CE）具有检测时间短，分离率较高，样品量小，溶剂消耗少等优点，但在监测的灵敏度方面要逊色于HPLC，与MS联机检测分析也逐渐运用于各种水样MC的测定研究。

酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）自80年代就开始于环境中MCs的检测，Chu首先提出ELISA检测MCs的完整程序,它是利用多克隆或单克隆抗体来检测MCs，具有高的灵敏度、快捷的分析速度，较强的特异性识别能力，测定水环境中。MCs时无需进行样品预浓缩。水环境中MCs的免疫检测中最常用的检测方法是竞争性非均相酶联免疫检测。

蛋白磷酸酶抑制分析（PPIA）是测定MCs总量的一种方法，它可以测定分子水平上MCs的毒性效应，分析时间短、操作简便、检测灵敏度高、检测限10-12级，但可能会因为蓝藻本身具有的内援蛋白磷酸酶活性使检测结果偏低。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制法（protein phosphatase inhibition assay，PPIA ）以来，PPIA得到了迅速发展不久前，有学者等制备出蛋白磷酸酶抑制的电化学传感器，尽管它与HPLC两者的检测结果间相关性较差，但是其简便、高灵敏度和宽线性范围的优点使其在粗略筛选、监测水样中MCs方面有很好的应用前景。

MMPB法是Sano等于1992年建立的，他们将MCs中Adda上的碳碳双键氧化断裂后得到2－甲基－3－甲氧基－4－苯丁酸（MMPB），对MMPB进行荧光衍生后用HPLC-FL法进行检测，检测限为10-12级。此法可用于样品中某一种MCs含量的测定，它灵敏度高，且无需MCs标准品，特别适合一些复杂样品如难以萃取的沉淀的检测，但耗时长，不能区分MCs同分异构体，也不能对总毒素进行定量。Harada等称其建立的利用臭氧分解产生MMPB的方法可将整个检测过程控制在30 min内，并能达到10-9级的检测限。Marcel Ethard等则称其所创建的MALDI-TOF-MS可以在数分钟内检测出微克级的毒素，并能同时检测出蓝藻所产生的小肽，利用这种技术可在数分钟内确定毒素肽的结构特征。

细胞毒性检测技术所检测的是能发挥出与MCs相同毒性作用的毒素的总量。该法是利用毒素对细胞的毒性作用对毒素进行检测的，不仅可以对毒素进行定性

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鉴定，而且能对其进行精确的定量测定。

另外，用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）测定饮用水中微囊藻毒素也成为个研究热点。张昱等采用SPE-HPLC-ESI-MS法分离检测水中三种痕量MCs，并将其用于对自来水厂源水中MCs的检测，灵敏度高，专属性强，检出限为0.5 ng•L-1，线性范围达三个数量级。王静等建立了水体中MC-LR、RR、LW、LF的UPLC-MS-MS分析方法，样品经固相萃取法富集净化后，用WatersUPLC-MS检测，突出的优点是快速，仅需5 min就可完成4种MCs的分离和检测。系列研究表明，MC-LR-TRFIA是目前报导的MC-LR检测中最灵敏的方法。孙蔚榕等将TRFIA应用于MCs的免疫学检测中，建立了时间分辨荧光间接竞争免疫分析方法（MC-LR-TRFIA），使其灵敏度和量程较ELISA成倍增加，灵敏度可达0.01 μg•L-1，测量范围为0.01 μg•L-1～20 μg•L-1。

表1 微囊藻毒素监测方法比较 监测技术 优点 缺点 最小检测限 半致死量和致死量来衡量 生物测试法 消耗较多的毒素、灵敏操作简单，结果直观、度和专一性不高；无法快速，可检测未曾发准确定量，不能辨别毒生的新毒素 素的异构体类型 可获得高灵敏度、建立的细胞系可方便实验 对不同毒素可进行精确的定性和定量 快速、准确、灵敏度高，可以测定不同的MC的异构体 可检测到毒素的不同同系物，商品试剂盒的出现大大方便了操作，灵敏度高 反映各种毒素的总量，检测灵敏度高而且测定时间较短、干扰较小，灵敏度更高 5

细胞毒素监测技术 高效液相色谱法（HPLC） 气相色谱法（GC-MS） 酶联分析法（ELISA） 生产工作量大 灵敏度较低、毒素需预处理、技术含量高，价格昂贵，各实验室的检测程序和条件差别大 技术含量高、操作复杂、需要标准毒素、前处理过程复杂 对多种同系物的识别需要广谱抗体 不能区分特异性的同系物、需要新制备的放射性底物、放射性废物的处理困难 10~20 ng/ml 1ng/ml 1ng/ml 0.20ng/ml 蛋白磷酸酶抑制分析法 2.5ng/ml 环境监测与分析技术

以上各方法各有优缺点，在实际应用中要灵活的联合运用。一种较理想的检测程序是先用ELISA或PPIA对水样进行“扫描”，若含有毒素，则用化学法对其进行鉴定并测定其含量。随着MC的危害逐渐被人们所认识，对水体中特别是饮用水源中微囊藻毒素进行监测已在世界范围内达成共识。建立灵敏可靠的监测方法并对淡水水体中的藻毒素进行监测，加强对环境水体的长期连续检测，以便采取适当措施减少这种危害是我们目前首要解决的问题。未来检测技术的发展方向稳定、快速、统一的动态监测网络的实现，实时的监测数据通过网络传输到中央计算机，这样才有利于了解湖泊、水库和河流等水体的水质情况。

人类对蓝藻毒素的摄入并不一定仅通过饮水、直接接触和血透析这三种途径，由于藻类毒素可通过食物链累积，供食用的水产品如鱼类、贝类等也可能携带藻毒素进而危害人类；另外，用地表水进行喷灌的农作物以及室外养殖的微藻食品都有受到藻毒素污染的危险。建立安全、快速的测定食品中藻毒素的检测方法也是我们迫切要解决的问题。为防止藻毒素对人类的危害，需进行更广泛而深入的研究，那么对其进行监测与分析也将具有重大意义。

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