一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106399356 A(43)申请公布日 2017.02.15

(21)申请号 201610824257.8(22)申请日 2016.09.14

(71)申请人 中国热带农业科学院热带生物技术

研究所

地址 571101 海南省海口市龙华区学院路4

号(72)发明人 言普　庹德财　付兰兰　沈文涛　

周鹏　(74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司

44202

代理人 郝传鑫　陈欢(51)Int.Cl.

C12N 15/82(2006.01)C12N 15/66(2006.01)

()发明名称

一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用(57)摘要

本发明提供一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用。本发明提供方法包括如下步骤：整个或分段扩增病毒基因组，表达载体线性化处理，基因组两端或各基因片段与表达载体两端分别设计有用于体外拼接的重叠序列；病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外拼接；拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。重组农杆菌用于接种，获得病毒的系统性侵染。本发明的创新点在于将病毒基因组与表达载体通过体外核酸拼接后，不转化大肠杆菌，而是转化农杆菌，获得在农杆菌中稳定的病毒侵染性克隆，避免了病毒在大肠杆菌中产生的毒性或不稳定现象，构建方法更为灵活和简便。

权利要求书1页 说明书6页序列表5页 附图4页

CN 106399356 ACN 106399356 A

权　利　要　求　书

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1.一种病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括：将具有病毒基因组的载体转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌，其中，所述具有病毒基因组的载体为采用体外克隆法或体外基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体。

2.如权利要求1所述的病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述采用体外克隆或基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体的步骤包括：

1)通过PCR整体或分段扩增病毒基因组，获得基因组片段或至少一个基因片段；所得基因组两端或各基因片段两端设计有用于体外拼接反应的重叠序列；

2)获得线性化表达载体；所得线性化的表达载体两端设计有用于体外拼接反应的重叠序列；

3)通过体外克隆或基因拼接法使病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外克隆或拼接，获得插入或拼接有病毒基因组的载体。

3.一种病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、通过PCR整体或分段扩增病毒基因组，所得基因组两端或各基因片段两端设计有用于体外拼接反应的接头序列；通过PCR扩增或酶切使表达载体线性化；所得线性化的表达载体两端设计有用于体外拼接反应的重叠序列；

2)、通过Gibson拼接、In-Fus ion拼接方法使病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外拼接；

3)、拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。

4.一种如权利要求1-3任一所述的方法所制备的含病毒侵染性克隆的重组农杆菌。5.如权利要求1-3任一所述的方法在构建在大肠杆菌中不稳定的病毒侵染性克隆中的应用。

6.如权利要求1-3任一所述的方法在构建马铃薯Y病毒属病毒侵染性克隆中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述马铃薯Y病毒属病毒包括番木瓜环斑病毒或番木瓜畸形花叶病毒。

8.一种病毒系统性侵染宿主的方法，其特征在于，为采用权利要求1-3任一所述的方法所制备的含病毒侵染性克隆的重组农杆菌接种宿主后使得病毒系统性侵染宿主。

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一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用

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技术领域[0002]本发明涉及病毒学和分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用。

背景技术[0004]侵染性克隆是病毒学研究领域的基础研究工具。克隆后的病毒基因组易于分子操作，因此，侵染性克隆在研究病毒的基因功能、侵染机理、病毒-宿主互作等方面具有重要作用。并且，病毒的侵染性克隆也可用作基因表达或沉默的载体。[0005]申请号201410706857.5(黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用)公开了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的侵染性克隆的构建方法，该病毒侵染性克隆由CGMMV全序列融合到带35S启动子和核酶的载体pCB301-CH后，将重组载体pCB301-CH转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆导入导入到农杆菌菌株EHA105获得病毒侵染性克隆。[0006]然而，上述专利及其类似技术方案在病毒侵染性克隆构建过程中存在的一个重要问题是，很多病毒在大肠杆菌中不稳定。由于很多病毒同时具有原核和真核表达的能力，它们在大肠杆菌中的表达产物会影响大肠杆菌的生长。因此，在构建病毒的侵染性克隆中经常会出现含病毒基因组的载体转化大肠杆菌后无法获得克隆菌落，或是获得的克隆菌落发生基因突变(碱基突变、片段缺失)的问题，给病毒侵染性克隆的构建带来了很大的障碍。例如马铃薯Y病毒属的番木瓜环斑病毒和番木瓜畸形花叶病毒，我们多次尝试将它们的基因组导入大肠杆菌，但无法获得序列正确的克隆。[0007]为解决这一障碍，目前有降低大肠杆菌培养温度、尝试不同大肠杆菌菌株、在病毒基因组插入内含子等方法。前两个方法存在效果不普遍或效果不明显的问题，而插入内含子的方法虽然能有效解决病毒毒性蛋白在大肠杆菌中表达的问题，但插入内含子数量及位置的确定需要大量的前期工作或摸索。[0008]因此，现有技术对于未能提供一种简单有效的、解决在大肠杆菌中不稳定的侵染性病毒克隆的方法。

发明内容[0010]针对侵染性病毒克隆构建过程中存在的问题，本发明第一方面提供病毒侵染性克隆的构建方法，包括：将具有病毒基因组的载体转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌，其中，所述具有病毒基因组的载体为采用体外克隆法或体外基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体。[0011]在本发明一个可选的实施例中，所述采用体外克隆或基因拼接法制备的插入或拼接有病毒基因组的载体的步骤包括：[0012]1)通过PCR整体或分段(优选为分2-5段)扩增病毒基因组；所得基因组两端或各基因片段两端设计有用于体外拼接反应的15-30bp重叠的接头序列；

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2)(通过PCR扩增、酶切等方法)获得线性化表达载体；所得线性化的表达载体两端

设计有用于体外拼接反应的重叠序列；[0014]3)通过Gibson拼接或In-Fusion拼接等常规体外接方法使病毒基因组与线性化表达载体进行体外拼接，获得插入或拼接有病毒基因组的载体。[0015]在本发明一个可选的实施例中，本发明第一方面提供一种简单有效的病毒侵染性克隆构建方法具体包括如下步骤：[0016]1)、通过PCR整体或分段(优选为分2-5段)扩增病毒基因组，基因组两端与表达载体两端(若分段扩增，则还包括各基因片段之间)分别设计有15-30bp重叠序列用于体外拼接反应；通过PCR扩增、酶切等方法使表达载体线性化；2)、通过Gibson拼接、In-Fusion拼接等方法使病毒基因组与线性化表达载体进行体外拼接；3)、拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。[0017]本发明第二方面提供了一种第一方面所述的方法所制备的含病毒侵染性克隆的重组农杆菌。[0018]本发明第三方面还提供了一种如第一方面所述的方法在构建在大肠杆菌中不稳定的病毒侵染性克隆中的应用。[0019]本发明第四方面还提供了一种如第一方面所述的方法所获得的重组农杆菌在构建马铃薯Y病毒属病毒的侵染性克隆中的应用。[0020]优选地，所述马铃薯Y病毒属包括番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)或番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV)。[0021]采用本发明第一方面提供病毒侵染性克隆构建方法，简单有效，具体地，正如本发明实施例所记载的，本发明实施例构建了的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)的侵染性克隆，其接种番木瓜后检测到病毒的系统侵染，并表现出典型症状；本发明实施例构建了的番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV)的侵染性克隆，其接种番木瓜后检测到病毒的系统侵染，并表现出典型症状。[0022]本发明的提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点：[0023]第一，利用农杆菌取代大肠杆菌来克隆含病毒基因组的载体,简单有效地解决了病毒侵染性克隆在大肠杆菌中的不稳定性问题，因此本发明提供的方法特别适合构建在大肠杆菌中不稳定的病毒的侵染性克隆，同时也适合其它病毒侵染性克隆的快速构建。[0024]第二，农杆菌可广泛侵染植物、藻类、真菌等生物，因此含有病毒侵染性克隆的农杆菌可直接接种这些生物，获得病毒的系统性侵染，简化了病毒侵染性克隆的构建和接种过程。[0025]第三，利用高效的DNA体外拼接方法(Gibson拼接、In-Fusion拼接等方法)，使得病毒基因组(整体或分段)与表达载体的拼接产物能直接转化农杆菌获得转化子，同时也易于进行较大病毒基因组的克隆、病毒基因组序列的修饰等操作。附图说明[0027]图1是本发明实施例提供的病毒侵染性克隆构建方法的步骤示意图，其核心是利用农杆菌取代大肠杆菌，并结合高效的DNA体外拼接方法来克隆病毒基因组。[0028]图2是实施例提供的PRSV基因组片段和载体线性化扩增电泳图，其中M：

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DL15000Marker(大连宝生物)；1：载体；2：基因组片段1；3:基因组片段2。[0029]图3是实施例提供的PRSV基因组转化农杆菌后的菌落PCR鉴定电泳图，其中M：DL2000Marker；1-22：随机挑选的22个农杆菌菌落；-：阴性对照；+：阳性对照。[0030]图4是实施例提供的含PRSV侵染性克隆的农杆菌接种番木瓜14天后的RT-PCR鉴定电泳图，其中M：DL2000Marker；1-3：检测的3株接种植株；+：阳性对照；-：阴性对照。[0031]图5是实施例提供的含PRSV侵染性克隆的农杆菌接种番木瓜30天后症状图。[0032]图6是实施例提供的PLDMV基因组片段和载体线性化扩增电泳图，其中M：DL15000Marker(大连宝生物)；1：载体；2：基因组片段1；3:基因组片段2。[0033]图7是实施例提供的PLDMV基因组转化农杆菌后的菌落PCR鉴定电泳图，其中M：DL2000Marker；1-29：随机挑选的29个农杆菌菌落；-：阴性对照；+：阳性对照。[0034]图8是实施例提供的含PLDMV侵染性克隆的农杆菌接种番木瓜14天后的RT-PCR鉴定电泳图，其中M：DL2000Marker；1-3：检测的3株接种植株；+：阳性对照；-：阴性对照。[0035]图9是实施例提供的含PLDMV侵染性克隆的农杆菌接种番木瓜30天后症状图。具体实施方式[0037]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0038]实施例1：番木瓜环斑病毒(PRSV)侵染性克隆的构建[0039](1)设计分段扩增PRSV基因组的引物并扩增获得基因组片段[0040]由于PRSV基因组较大(约10kb)，PCR扩增整个基因组难度较大，因此设计为分两段扩增。其中，扩增片段1的引物为：[0041]上游引物(SEQ ID NO:1)：[0042]AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAAATAAAACATCTCAACACAACACAAGT(其中有下划线的序列为与表达载体进行体外拼接时的接头序列)；[0043]下游引物(SEQ ID NO:2)：TATGTCTCTTGCGTTCTGGCGAATTTC；[0044]扩增片段2的引物为，上游引物(SEQ ID NO:3)：AATTCGCCAGAACGCAAGAGACATAC，[0045]下游引物(SEQ ID NO:4)：[0046]CGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTCATTCCAAGAGGTTCGAATAAC(其中有下划线的序列为与表达载体进行体外拼接时的接头序列)。[0047]片段1的下上游引物和片段2的上游引物设计为有25bp反向互作，使得扩增获得的片段1和片段2有25bp的重叠区域，用于拼接反应。[0048]提取感染PRSV的番木瓜叶片的RNA，反转录成cDNA，以其为模板，利用上述两对引物，使用Phusion高保真聚合酶(Thermo Scientific公司)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：98℃30秒；再98℃10秒，55℃20秒，72℃3分钟，30个循环；最后72℃延伸8分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。电泳结果显示扩增得到1条约4000bp和1条约6000bp的条带，与预期大小的符合。因此将2个条带进行回收，回收利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生

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工)，按照说明书进行。[0049](2)设计扩增表达载体的引物并扩增使得载体线性化[0050]选用以pGreen为框架，含35S启动子和CaMV polyA终止子的植物表达载体pGreen-35S，作为PRSV侵染性克隆的表达载体。PRSV基因组插入到pGreen-35S载体的启动子和终止子之间，将使病毒在植物中表达。[0051]在pGreen-35S载体的启动子和终止子的连接处设计1对引物，上游引物(SEQ ID NO:5)：GAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGGTACGCTGAAATCACCAGTCTC(其中有下划线的序列为与PRSV的片段2进行体外表达拼接时的接头序列)，下游引物(SEQ ID NO:6)：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT(与PRSV片段1的上游引物反向互补)。[0052]利用该对引物，以pGreen-35S为模板，使用Phusion高保真聚合酶(Thermo Scientific公司)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：98℃30秒；再98℃10秒，55℃20秒，72℃2分钟，30个循环；最后72℃延伸6分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。电泳结果显示扩增得到预期大小的条带，切胶回收该条带，获得在启动子和终止子之间断开的线性化表达载体pGreen-35S。[0053](3)基因组片段和表达载体进行体外拼接[00]将上述扩增获得的PRSV基因组的2个片段与线性化表达载体进行Gibson拼接反应。反应体系为基因组片段各3.5ul，线性化载体3ul，Gibson反应液(NEB)10ul。反应条件为50℃反应1h。[0055](4)拼接产物转化农杆菌[0056]取10ul上述拼接产物，通过电击法转化农杆菌感受态细胞。转化细胞涂布于含利福平和卡那霉素的平板，28℃培养48h至出现菌落。随机挑选22个菌落进行PCR鉴定，所用引物为，上游引物(SEQ ID NO:7)：GAAATGGAAATTTCTTATGGGGTGAG，下游引物(SEQ ID NO:8)：CGTTGGCCGCATCGGGATGGAAAAT。PCR扩增后电泳，结果见图3，22个克隆中有16个出现目标条件，显示了本发明提供的方法在构建病毒侵染性克隆中的高效性。[0057](5)农杆菌接种番木瓜获得病毒的系统性侵染[0058]采用注射法将含PRSV侵染性克隆的农杆菌注射到番木瓜叶片，并接种田间采取的PRSV作为对照。14天后提取叶片RNA，利用RT-PCR检测病毒，所用引物与上述菌落PCR所用引物相同，即为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。RT-PCR检测结果显示所测3株接种植株中均能检测到病毒(图4)，表明接种的PRSV侵染性克隆可系统性侵染番木瓜。接种30天后，接种PRSV侵染性克隆和接种田间采取的PRSV的植株均出现相似的典型症状，表现为叶片出现环斑和叶畸形(图5)，这进一步表明PRSV侵染性克隆构建成功。[0059]实施例2：番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)侵染性克隆的构建[0060](1)设计分段扩增PLDMV基因组的引物并扩增获得基因组片段[0061]由于PLDMV基因组较大(约10kb)，PCR扩增整个基因组难度较大，因此设计为分两段扩增。其中扩增片段1的引物为：[0062]上游引物(SEQ ID ON:9)：[0063]AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAAAAAATATAAAAACTCAACAAAACTTATGC(其中有下划线的序列为与表达载体进行体外拼接时的接头序列)，[00]下游引物(SEQ ID NO:10)：CACATTTCTCGTAATTTTTCCAACC；

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扩增片段2的引物为，上游引物(SEQ ID NO:11)：GGTTGGAAAAATTACGAGAAATGTG，

[0066]下游引物(SEQ ID NO:12)：[0067]CGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTCCTTGCTTAGTCTGAAGTTCC(其中有下划线的序列为与表达载体进行体外拼接时的接头序列)。片段1的下游引物和片段2的上游引物设计为有25bp反向互作，使得扩增获得的片段1和片段2有25bp的重叠区域，用于拼接反应。[0068]提取感染PLDMV的番木瓜叶片的RNA，反转录成cDNA，以其为模板，利用上述两对引物，使用Phusion高保真聚合酶(Thermo Scientific公司)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：98℃30秒；再98℃10秒，55℃20秒，72℃3分钟，30个循环；最后72℃延伸8分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6。电泳结果显示扩增得到1条约4000bp和1条约6000bp的条带，与预期大小的符合。因此将2个条带进行回收，回收利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)，按照说明书进行。[0069](2)设计扩增表达载体的引物并扩增使得载体线性化[0070]选用上述pGreen-35S作为PLDMV侵染性克隆的表达载体。PLDMV基因组插入到pGreen-35S载体的35S启动子和CaMV polyA终止子之间，将使病毒在植物中表达。在pGreen-35S载体的启动子和终止子的连接处设计1对引物，上游引物(SEQ ID NO:13)：GGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGGTACGCTGAAATCACCAGTCTC(其中有下划线的序列为与PLDMV的片段2进行体外表达拼接时的接头序列)，下游引物(SEQ ID NO:14)：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT(与PLDMV片段1的上游引物反向互补)。利用该对引物，以pGreen-35S为模板，使用Phusion高保真聚合酶(Thermo Scientific公司)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：98℃30秒；再98℃10秒，55℃20秒，72℃2分钟，30个循环；最后72℃延伸6分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6。电泳结果显示扩增得到预期大小的条带，切胶回收该条带，获得在启动子和终止子之间断开的线性化表达载体pGreen-35S。[0071](3)基因组片段和表达载体进行体外拼接[0072]将上述扩增获得的PLDMV基因组的2个片段与线性化表达载体进行Gibson拼接反应。反应体系为基因组片段各3.5ul，线性化载体3ul，Gibson反应液(NEB)10ul。反应条件为50℃反应1h。[0073](4)拼接产物转化农杆菌[0074]取10ul上述拼接产物，通过电击法转化农杆菌感受态细胞。转化细胞涂布于含利福平和卡那霉素的平板，28℃培养48h至出现菌落。随机挑选29个菌落进行PCR鉴定，所用引物为，上游引物(SEQ ID NO:15)：AAACCTGTCAAGAAATCTTGTGTAA，下游引物(SEQ ID NO:16)：AACGCAAATGGTAGACCAGTAGATT。PCR扩增后电泳，结果见图7，29个克隆中有26个出现目标条件，再次显示了本发明提供的方法在构建病毒侵染性克隆中的高效性。[0075](5)农杆菌接种番木瓜获得病毒的系统性侵染[0076]采用注射法将含PLDMV侵染性克隆的农杆菌注射到番木瓜叶片，并接种田间采取的PLDMV作为对照。14天后提取新长出叶片的RNA，利用RT-PCR检测病毒，所用引物与上述菌落PCR所用引物相同，即为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。RT-PCR检测结果显示所测3株接种植株中均能检测到病毒(图8)，表明接种的PLDMV侵染性克隆可系统性侵染番木瓜。接种30天后，接种PLDMV侵染性克隆和接种田间采取的PLDMV的植株均出现相似的典型症状，表

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现为叶畸形(图9)，这进一步表明PLDMV侵染性克隆构建成功。[0077]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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