一． 实验目的
1. 了解微生物纯培养的目的与方法。 2. 掌握分离纯化微生物的几种方法。
3. 掌握通过用涂布平板法对微生物进行计数的方法。
二． 实验原理
1. 微生物纯培养的原理
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，纯培养物通常是通过人工培养方法获得的。获得纯培养物的关键有两点：（1）所有相关物品必须是无菌的。（2）分离单个微生物细胞并将其培养成一个群体。
2. 分离纯化微生物的几种方法
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。混合样品的分离方法包括两大步骤，使菌体浓度得到稀释使微生物的细胞或孢子以单独的状态存在，在适宜条件下形成菌落。如果将其接种到适当的培养基上就得到了纯种的微生物。
分离纯化微生物的方法包含两类：一是达到菌落水平，另一类是达到细胞水平。菌落分离纯化方法包括：平板划线法，平板涂布法和倾注分离法。细胞分离纯化方法包括：单孢分离法和菌丝顶端切割法。平板划线法，平板涂布法和倾注分离法因方法简便、设备简单分离效果良好而被广泛使用。 （1） 平板划线法原理：当通过划线法分离微生物时，培养物在固体培养基上通 过划线被稀释。划线的目的是使细菌细胞间的空间足够大，这样单个细胞繁殖所产生的大量后代就会形成一个菌落。由此可见，菌落就是在固体培养基表面由单个微生物繁殖形成的肉眼可见的细胞集团，菌落也可以是由一群同类微生物繁殖形成。挑取但菌落进行扩大培养就是纯培养。
（2）平板涂布法原理：将经过适当稀释的一定体积的菌液加到已凝固的平板培养基表面，然后用无菌涂布器速将其涂布均匀，如果涂布适宜，经培养后，在平板表面可以得到但菌落，从而达到离纯化微生物的目的。平板涂布法还可以用于微生物平板菌落计数。
（3）倾注接种法原理：将待分离培养的菌液经过适当的稀释后，取合适稀释度的少量菌液加到无菌平皿中，然后加入融化并冷却至50℃左右的培养基，充分混匀，待凝固，在适宜温度下培养一段间，如果稀释得当，经培养后，可以从平板表面或内部长出单落，从而达到离纯化微生物的目的。倾注接种法也常用于微生物平板菌落计数，如水或牛奶的活菌数测定。
在平板涂布法和倾注接种法中，平板涂布法比较适合于好氧细菌和有气生菌
丝的放线菌的分离，而倾注接种法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离。
3. 平板计数原理：
稀释平板计数法是一种最常用的活菌计数法。其依据是微生物在高度稀释的条件下，在固体培养基上形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖形成的，因此一个菌落形成单位代表一个细胞。在计数的时候，首先将待测样品进行系列稀释，使待测样品中的微生物细胞成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种到固体培养基中（平板接种培养有两种方法：平板涂布法和倾注接种法，我们使用的是平板涂布法），使其均匀地分布于培养基的表面或内部（倾注接种法），经适宜培养后，单个细胞生长繁殖形成菌落，计数菌落数目，即可换算出样品中的含菌数目。
平板菌落技术法常用语生物制品的检验、土壤含菌量的测定以及食品、水源的污染程度的检验等。
三． 实验材料
1. 菌种：大肠杆菌菌液。 2. 培养基：LB固体培养基。
3. 仪器：无菌涂布器、无菌吸管6支、接种环、无菌培养皿、5支盛有4.5mL无菌水的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、马克笔。
四． 实验步骤
1. 涂布平板法
（1） 培养皿、吸管和试管编号：取6只无菌的培养皿，分别标号10-3、10-4、 10-5 三种稀释度，各两皿（标准操作为每组三个皿，此处只为练手用两个皿）。将5只试管分别标注1,2,3,4,5表示稀释倍数。将6只吸管分别标记1,2,3,4,5,6，以方便吸取菌液。
（2） 制备无菌平板：点燃酒精灯，将融化并冷却至50℃ 左右的培养基（手触 摸不烫手）倒入无菌培养皿中，倒的时候右手握住三角瓶的瓶身或者是瓶底，不要握住瓶口，因为倒平板时要先将瓶口加热，用手握住瓶口容易烫伤并且也握不稳。操作过程中要用左手食指和大拇指拿稳皿盖，剩下三个指头拖住皿身，使其尽量水平在酒精灯附近操作。倒平板的时候大约每个倒15~20ml,太少了涂平板时容易涂破，太多了造成浪费。倒完后将培养皿盖上平行沿着桌面慢慢推向桌子里面。平置待凝。 （3） 稀释菌液：。取5支盛有4.5mL无菌水的试管，稀释倍数依次为10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5。用1ml无菌吸管（看清吸管的量程）吸取0.5mL已充分混匀的大肠杆菌菌液（待测样品），放至装有4.5ml无菌水带有标记1的试管中，
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此即为10倍稀释。将10稀释的试管振荡使菌液充分混匀。另取一支1mL无菌吸管插入1号试管中吸取10-1已充分混匀的菌液0.5ml，放至装有4.5ml无菌水带有标记2的试管中，此即为100倍稀释。依次类推，直至最后用吸管吸取10-5菌液0.5ml放至装有4.5ml无菌水5号标记的试管中，此即为105倍稀释。（取菌液时按照由1号到5号吸管的顺序分别取液，其中4号吸管用于吸取10-3的菌液，5号吸管用于吸取10-4的菌液，6号吸管用于吸取10-5的菌液）
（4） 加菌液并涂布均匀：稀释完菌液后，固体培养基已经冷凝，分别用4,5,6
号吸管吸取10-3、10-4、10-5稀释的菌液各0.2ml,小心地滴在平板培养基表面中央位置加于相应编号的无菌培养皿中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀（顺序：先涂低浓度再涂高浓度，这样不用洗涂布器），使菌液均匀铺满整个培养皿表面。（用涂布器之前要现在酒精灯上烤一烤，待冷却后再涂布） （5） 培养:将冷凝的固体培养基倒置于37℃温室中培养24～48h。（此步骤之 前培养基均正向放置）
2. 平板划线法
（1） 培养皿的标记：将自己的培养皿做好标记。 （2） 制备无菌平板：方法同上“涂布平板法”。
（3） 划线。在近火焰处，左手拿培养皿，拿皿方法同上“涂布平板法”，右手 拿接种环，挑取大肠杆菌菌液一环在平板上划线。（划线之前将接种环环口在酒精灯上烤到红热后再来回烤烤铁丝环身，冷却一段之间蘸取菌液划线），用接种环蘸取大肠杆菌菌液，先在平板培养基的一边作第一次平板划线，连续划几个来回的平行弧线（可以不用取很多菌液，因为第一次划线菌液浓度很大），再转动培养皿约70度，在酒精灯上灼烧接种环上剩余物，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分做第四次平行划线（第四次划线时可以不用酒精灯再烤接种环了，因为第三次划线时浓度已经很小，第四次划线尽可能地将菌落划开）。通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
（4） 培养:将冷凝的固体培养基倒置于37℃温室中培养24～48h。（此步骤之 前培养基均正向放置）
注：涂布平板法和平板划线法获得的单个菌落均可作为单克隆进行纯培养。
3. 涂布平板计数法
从培养箱中取出培养皿，分别在-3、-4、-5倍稀释的培养皿中计单个菌落的数目，以平均值得到最后的结果。分别计算稀释的菌液里1ml菌液所含菌的数量。
五． 实验结果
1. 在平板划线法得到的菌落中可见第一次划线和第二次划线得到的菌落（由于培养时间比较短，没有得到四次划线的结果），第一次划线的菌落密集，第二次划线的菌落稀疏，可以观察到单个菌落（图1）。
2. 在涂布平板计法中所见到的三种密度的菌落中-3倍稀释得到的菌落密度最低（图2），-4倍其次（图3），-5倍最高。通过平板计数得到0.2ml 10-3的菌液在37℃温室中培养48h后，形成了680个单菌落。那么1ml10-3的菌液在37℃温室中培养48h后，能形成3400个单菌落。
图1图2 图3
六． 问题与讨论
1. 用棉花塞吸管的时候不能塞得太紧，也不要塞得过松。塞得太松灭菌效果不好，如果塞得太紧，灭完菌后，再用的时候不容易吸入和吹出液体。我们组灭菌的六只吸管就有一只由于塞棉花塞得太紧吸菌液吸不上来。 2.每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液。否则稀释不精确。
3.一般同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误 差。此实验为了节约时间和试剂每组只用了用两个皿。 4. 凡是无菌操作都应该在酒精灯附近进行。
5. 用三角瓶到平板的时候右手握住三角瓶的瓶身或者是瓶底，不要握住瓶口，因为倒平板时要先将瓶口加热，用手握住瓶口容易烫伤并且也握不稳。操作过程中要用左手食指和大拇指拿稳皿盖，剩下三个指头拖住皿身，使其尽量水平在酒精灯附近操作。
6. 倒平板的时候大约每个倒15~20ml,太少了涂平板时容易涂破，太多了造成浪费。
7. 倒完平板后，将培养皿盖上平行沿着桌面慢慢推向桌子里面，以保证LB固体培养基在冷凝过程中表面能够保持水平，利于之后涂平板操作。
8.用无菌吸管时，一定要看清吸管的量程，是1ml还是10ml。本次实验很多同学都把1ml的吸管当作是是10ml的吸管了，导致加样过程中造成了许多人为误差。
9. 取菌液时按照由1号到5号吸管的顺序分别取液，其中4号吸管用于吸取10-3
的菌液，5号吸管用于吸取10-4的菌液，6号吸管用于吸取10-5的菌液。本次实验数的菌液偏多就是因为用的3号吸管用于吸取10-3的菌液，4号吸管用于吸取10-4的菌液，5号吸管用于吸取10-5的菌液。造成误差的原因是：原本取样时，1号吸管吸取的是原液，2号吸管吸取的是10-1倍稀释液，3号吸管吸取的是10-2稀释液，而我们组加样时却用了3号吸管吸取了10-3稀释液，以此类推，导致我们的实验结果都偏大了。
10.涂布平板法涂布时，先涂低浓度菌液再涂高浓度菌液，这样不用每次涂完后再清洗涂布器，节省时间。
11.平板划线法涂布之前，要将接种环环口在酒精灯上烤到红热状态，防止杂菌污染。
12. 平板划线法涂布时，由于第一次划线菌液浓度很大，可以不用取很多菌液，如果取了过多菌液，则难以形成单菌落。
13.在第四次划线时可以不用酒精灯再烤接种环，因为第三次划线时浓度已经很小，第四次划线很容易形成单菌落。
14.无论是涂布平板法还是平板划线法，涂布时都应该注意在特定的时候要应在酒精灯上来回烤涂布器和接种环，防止杂菌污染。 15. 在将培养皿放入培养箱之前，培养基均正向放置。放入培养箱之后，培养基要倒置，防止培养皿皿盖上的水蒸气形成水珠脱落在培养基上，造成菌落漂浮移动，不易形成单菌落。
七． 参考文献
1. 徐威，2014，微生物学实验。
2. 沈萍，范秀容，李广武，1999，微生物学实验
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