检测分析 ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５—６５２１．２０１３．０５．０２３ 食品讲究与开发 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１３年３月 第３４卷第５期 ８７ ＨＰＬＣ测定白酒中的氨基甲酸甲酯和 氨基甲酸乙酯 谭文渊，袁东。付大友，李艳清，王蓉 （四川理工学院，四川自贡６４３０００） 摘要：建立了一种高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）同时测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯。其ＨＰＬＣ条件为：色 谱柱，Ｌｕｎａ ５ｕ ＮＨ２ １００Ａ（２５０ ｍｍ￣４．６０ ｍｍ ｉ．ｄ．，５ ｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ公司）；流动相，乙腈：水＝８０：２０（体积比）；流速 Ｏ．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长１９５ ｎｍ；柱温２Ｏ℃；进样量２０ Ｌ。样品采用氨基固相小柱萃取净化、氮吹浓缩处理。结果表 明，氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯在０．１ Ｉ￣ｇ／ｍＬ～２０ ｔｘｇ／ｍＬ范围内线性关系良好，相关系数ｒ为０．９９２ ３和０．９８１ １。平 均回收率为８５．００％和８４．２２％，ＲＳＤ为６．７％和６．１％。 关键词：液相色谱；氨基甲酸甲酯；氨基甲酸乙酯；白酒 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌ Ｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎｄ Ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｏｒ ｂｙ ＨＰＬＣ ＴＡＮ Ｗｅｎ—ｙｕａｎ，ＹＵＡＮ Ｄｏｎｇ，ＦＵ Ｄａ－ｙｏｕ，ＬＩ Ｙａｎ－ｑｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｒｏｎｇ （Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ ６４３０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｌｉｑｕｏｒ．Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：Ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ－Ｌｕｎａ ５ ＣＮ １００ Ａ （２５０ ｍｍｘ４．６ ｍｍ ｉ．ｄ．，５ ｔｘｍ），ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：ｗａｔｅｒ＝８０：２０（ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ），ｌｆｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ １９５ ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ２０℃ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ２０ ｐ，Ｌ．Ｔｈｅ ｌｉｑｕｏｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＳＰＥ（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＮＨ２）ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｂｌｏｗ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．２ ｐ￣ｇ／ｍＬ－２０ ｐ￣ｇ／ｍＬ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｒ ｗｅｒｅ ０．９９２ ３和０．９８ １ １．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ ｗｅｒｅ ８５．Ｏ０％ａｎｄ ８４．２２％．ＲＳＤ ｗｅｒｅ ６．７％ａｎｄ ６．１％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ；ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ；ｌｉｑｕｏｒ 白酒是中国特有的一种蒸馏酒，在我国具有悠久 的历史，长久以来也一直被世界各地的人们大量消 耗，但在白酒的发酵蒸馏过程中，极易产生副产物氨 基甲酸甲酯（Ｍｅｔｈｙｌ Ｃａｒｂａｍａｔｅ，简称ＭＣ）和氨基甲酸 ￣（Ｅｔｈｙｌ Ｃａｒｂａｍａｔｅ，简称为ＥＣ） 。国内外已有相 关报道在一些酒精饮料中检测出了ＭＣ或ＥＣ［３－－８１，ＭＣ 品安全和公众健康，以及促进我国对于相关限量标准 的制定都具有重要的意义。本文研究对样品采用氨基 固相萃取小柱纯化及氮吹浓缩处理，然后用ＨＰＬＣ进 行定性定量分析。 １材料与方法 和ＥＣ对人体有害，易引发肺癌和肝癌 。许多国家都 １．１仪器与试剂 已有酒精饮料中ＭＣ和ＥＣ相关的一些限量标准，但 受多方面的限制，在我国还没有相关标准出现。因此， 对白酒中ＭＣ和ＥＣ含量的测定和调查，对于关注食 基金项目：四川省教育厅应用技术研究与开发项目（Ｏ８ＺＱＯ２６—０５９） Ａｇｉｌｅｎｔ １ １００系列高效液相色谱：美国安捷伦公 司；ＭＴＮ一２８００Ｄ固相萃取装置、ＡＳＥ一１２氮吹仪：天津 奥特赛恩斯仪器有限公司；ＲＥ一２０００旋转蒸发器：上 海亚荣生化仪器厂；ＵＰ２５０Ｈ超声波清洗机：南京电子 计量有限公司；ＡＲ１１４０电子天平（精确到０．０００ １ ｇ）： 梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；甲醇、乙腈、乙 作者简介：谭文渊（１９８ｏ＿－），男（汉），实验师，工学硕士，主要从事仪 器分析方向研究。 谭文渊，等：ＨＰＬｃ测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯 检测分析 －＝＝８８ 酸、异丙醇均为色谱纯；乙酸乙酯、丙酮、环己烷均为分 析纯；ＨＰＬＣ专用纯净水；混合洗脱溶剂；ＭＣ和ＥＣ标 准储备液：分别准确称取ＭＣ和Ｅｃ各５０．０ ｍｇ，分别置 于２５ ｍＬ容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，制成 ２．０ ｍｇ／ｍＬ的标准储备液，放人冰箱中冷藏；ＭＣ和Ｅｃ 工作溶液：从储备液中移取１００ ＩｘＬ到１０ ｍＬ的容量瓶 中，用乙腈定容为２０ ｔｘｇ／ｍＬ的工作溶液；白酒样品：市 场购买。 １．２试验条件 色谱柱，Ｌｕｎａ ５ｕ ＮＨ２ １００Ａ（２５０ ｍｍｘ４．６０ ｍｍ ｉ．ｄ．， ５ ｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ公司）；流动相，乙腈：水＝８０：２０（体积 比）；流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长１９５ ｎｍ；柱温２０ ｏＣ；进 样量２０ Ｌ。 １．３样品处理 用量筒准确量取５０ ｍＬ待测白酒样品于球型滴液 漏斗中，用５ ｍＬ正己烷溶液活化氨基柱，调节漏斗开 关，缓慢将５０ ｍＬ酒样通过活化好的氨基柱，再将５ ｍＬ 甲醇／乙酸乙酯（２／３，体积比）溶液淋洗萃取柱后，用 ８ ｍＬ甲醇／乙酸乙酯（２／３，体积比）溶液洗脱萃取柱， 将淋洗液和洗脱液合并装入氮吹管中，在氮吹仪上吹 干，用乙睛定容至２ ｍＬ，待ＨＰＬＣ分析。 ２结果与讨论 ２．１试验条件的优化 我们主要考察了固相萃取条件和ＬＣ检测条件的 选择。在固相萃取操作中，我们采用能与氨基化合物 形成氢键的氨基萃取小柱，但萃取小柱需经带有弱极 性的溶剂活化，经过比，我们发现用５ ｍＬ正己烷溶液 活化氨基柱，用８ ｍＬ的甲醇一乙酸乙酯（２／３，体积比） 的洗脱效果最好；ＬＣ检测条件的优化是使样品色谱 峰取得较好的分离效果且干扰较小，并在此基础上， 进一步优化其它参数。我们进行了二极管阵列检测器 波长扫描选择最大吸收波长，考察了Ｅｎｖｉｒｏｓｅｐ—ＣＭ （１７５ ｍｍｘ３．２０ ｍｍ ５ Ｉｘｍ）、ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ—Ｃ１８ 柱（１５０ ｍｉｎＸ４．６ ｍｍ ｉ．ｄ．，５ ｍ）、Ｌｕｎａ ５ｕ ＮＨ２（２５０ ｍｍｘ ４．６０ ｍｍ ５ ｍ）１００Ａ ３种色谱柱对标样的分离情况，并 进行了流动相种类和流速的选择，实验结果表明，色 谱柱，Ｌｕｎａ ５ｕ ＮＨ２ １００Ａ（２５０ ｍｉｎｘ４．６０ ｍｍ ｉ．ｄ．，５ Ｉｘｍ）； 流动相，乙腈：水＝８０：２０（体积比）；流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检 测波长１９５ ｎｍ；柱温２０ ｃＩ＝时，可满足分析的要求。在 该条件下得到的ＭＣ和ＥＣ色谱图，如图１。 ２．２标准曲线和检出限 本实验分别配制了０．１、０．２、２．０、４．０、８．０、１０．０、 ２０．０ ｇ／ｍＬ的ＭＣ和Ｅｃ标准溶液，在上述操作条件 时间／ｍｉｎ 图１氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＭＣ ａｎｄ ＥＣ 下分别进样分析，平行测定５次取平均，进样量均为 ２０ Ｌ，以标样浓度（ｘ，￣ｇ／ｍＬ）对相应的峰面积（Ｙ）进 行线性回归，得到ＭＣ和ＥＣ的线性范围、线性方程、 和相关系数及检出限见表１。 表１方法的线性范围、线性方程、相关系数及检出限 Ｔａｂｌｅ １ Ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ，ｌｉｎｅａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ。ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ２．３方法的回收率和精密度 在空白白酒样品中分别添加５个不同浓度水平 （浓度分别为１０．０、２０．０、３０．０、４０．０、５０．０￣ｇ／Ｌ）的ＭＣ和 ＥＣ农药的标准溶液，充分混合后，按照１．２和１．３的实 验条件进行回收率实验。每个添加浓度平行测定７次， 结果见表２。 表２白酒样品的加标回收率和精密度 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｏｒ ｓａｍｐｌｅｓ Ｒ ２．４样品的测定 从市场购买了２４种白酒样品，按所建立的方法进 行处理，每种酒样平行测定６次取平均，测定结果见表 ３，典型样品图见图２。 检测分析 谭文渊，等：ＨＰＬＣ￣， 定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯 ８９ 表３样品中氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯的分析结果（ｎ＝６） Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ ｌｉｑｕｏｒ ｓａｍｐｌｅｓ 注：一为未检出。 参考文献： ３０ ２５ ［１］李艳清＿白酒中氨基甲酸甲酯农药残留量的测定与调查［Ｊ１．酿酒 科技，２００６，１４７（９）：２１—２４ ［２］高年发，宝菊花．氨基甲酸乙酯的研究进展［Ｊ］．中国酿造，２００６， １６２（９）：１－４ ｊ ２０ ｛ １５ １０ ５ Ｏ １ ２ ３ ４ ［３］李艳清，谭文渊，王蓉，等．白酒中氨基甲酸甲酯农药残留量的ＧＣ／ ＭＳ测定方法研究［Ｊ１＿酿酒科技，２００８，１６８（６）：１０６—１０９ ［４］吴平谷，陈正冬．固相萃取结合ＧＣ／ＭＳ法测定酒中氨基甲酸乙酯 【ＪＪ．卫生研究，２００３，３３（５）：６２７—６２８ 图２典型白酒样品色谱图 Ｆｉｇ．２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｌｉｑｕｏｒ ｓａｍｐｌｅ ［５］Ｄｉｒｋ Ｗ Ｌａｃｈｅｎｍｅｉｅｒ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ ｓｔｏｎｅ—ｆｒｕｉｔｓｐｉｒｉｔｓ Ｕｓｉｎｇ ｈｅａｄｓｐａｃｅｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏ— ３结论 ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００６，１１０８（１）：１１６－１２０ 本文采用氨基固相萃取小柱对白酒中的ＭＣ和 ＥＣ进行了有效的提取，氮吹浓缩，并建立了一种ＬＣ 方法对ＭＣ和ＥＣ进行了定性定量分析方法。选定的 【６］高年发，孙晓雯，张健，等．ＨＰＬＣ测定白兰地中的氨基甲酸乙酯［ＪＩ． 中国酿造，分析与检测，２００８，１９０（１３）：８４—８７ ［７］ Ｒｏｂｅｒｔｏ ＲｏｄｒｇｕｅｚＭａｄｒｅｒ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ ｅｉｄｅｒｓｐｉｉｒｔｓ ｂｙ ＨＰＬＣ—ＦＬＤ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００９，１３８（２／３）：１３９—１４３ ［８］Ｅ Ｃｒｅｓｐｏ—Ｃｏｒｒａｌ，Ｍ Ｊ Ｓａｎｔｏｓ—Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｌ Ｍ Ｐｏｌｏ－Ｄｌｅｚ．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｅｔｈｙｌ ｅａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ—ｄｒｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｎｄｒｉｎｋｉｎｇ ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ｌｃ条件为：色谱柱，Ｌｕｎａ ５ｕ ＮＨ２ １００Ａ（２５０ ｍｍｘ４．６０ ｍｍ ｉ．ｄ．，５ Ｉｘｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ公司）；流动相，乙腈：水＝８０：２０ （体积比）；检测波长１９５ ａｍ；柱温２０ ｏＣ；进样量２０ Ｌ。 通过对方法精密度和准确度的考察，所建立的方法具 有良好的精密度和准确度，并且具有样品处理简单、 检测限低、分析时间短、实用性强等特点，易于掌握和 推广，可用于白酒中ＭＣ和ＥＣ的测定，具有广泛的应 用前景。 ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｃｈａｒｃｏａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００９，２０（１０）： ９４６－９５２ ［９］Ｓｕｎｇ—Ｋｕｇ Ｐａｒｋ，Ｃｈｅｏｎｇ Ｔａｅ Ｋｉｍ，Ｊｏｏ—Ｗｏｎ Ｌｅｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｓｏｙ ｓａｕｃｅ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｒ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ— ｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ ｃｏｎｔｒｏｌ，２００７，１８（８）：９７５—９８２ 收稿日期：２０１２—０８—１９ ◆●●◆ ◆◆ ◆ 《食品研究与开发》编辑部常年办理订阅手续 地址：天津市静海经济开发区（天宇园）科技大道９号 邮编：３０１６０９ 邮汇收款人：《食品研究与开发》编辑部 电话：０２２—５９５２５６７ １
