*CN103194441A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103194441 A(43)申请公布日 2013.07.10
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310134586.6(22)申请日 2013.04.17
(71)申请人新疆农垦科学院
地址832000 新疆维吾尔自治区石河子市乌
伊路221号新疆农垦科学院(72)发明人甘尚权 高蕊 王立民 沈敏
王新华 刘守仁(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人关畅 任凤华(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)C12N 15/11(2006.01)
权利要求书2页 说明书11页权利要求书2页 说明书11页
序列表2页 附图4页序列表2页 附图4页
(54)发明名称
获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物(57)摘要
本发明公开了获取miRNA的候选靶基因的方法及其专用反转录引物。该方法包括：1）以带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，获取与目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；以带特异接头和2）14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，获取真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20；3）将所述A库和所述B库合成双链cDNA后进行杂交得到杂交DNA分子，扩增所述杂交DNA分子上所述目的miRNA种子序列和所述特异接头之间的DNA片段，根据所述扩增产物得到目的miRNA的候选靶基因。CN 103194441 ACN 103194441 A
权 利 要 求 书
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1.获取miRNA候选靶基因的方法，包括：1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%-62%，环部不配对碱基数≤6个，且能值低于-30.00kcal/mol；所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；
2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；
3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。
2.获取miRNA与mRNA的候选结合位点的方法，包括：1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%-62%，环部不配对碱基数≤6个，且能值低于-30.00kcal/mol；所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；
2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转
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权 利 要 求 书
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录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；
3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA与mRNA的候选结合位点；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述真核生物目的组织为羊、猪或牛骨骼肌，所述目的miRNA为在骨骼肌中表达的miRNA。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述反转录引物A的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X，所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述引物A1的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG；和/或，
所述反转录引物B的核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT，其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA为特异接头的核苷酸序列，所述引物B1的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述反转录A在42℃或37-42℃进行；所述合成所述A库的cDNA第二条链在16℃或15～25℃进行。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述扩增为PCR扩增，所述PCR扩增采用的引物退火条件为65℃退火30s。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2-3min，30个循环；72℃延伸10min。
8.权利要求1-3中任一所述的反转录引物A。
9.用于获取miRNA的候选靶基因的成套反转录引物，由独立包装的权利要求1-4中任一所述的反转录引物A和权利要求1-4中任一所述的反转录引物B组成。
10.用于获取miRNA的候选靶基因的成套引物，由独立包装的权利要求1-4中任一所述的反转录引物A、权利要求1-4中任一所述的引物A1、权利要求1-4中任一所述的反转录引物B和权利要求1-4中任一所述的引物B1组成。
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说 明 书
获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物
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技术领域
[0001]
本发明涉及获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物。
背景技术
微小RNA（microRNA，miRNA)是一类小分子非编码RNA，约为22碱基大小。其通
过结合靶基因的3’非翻译区（3’UTR）造成靶基因mRNA的降解或靶蛋白翻译的抑制。研究表明miRNA的生物功能是通过调控靶基因而实现的，miRNA通过作用于相应靶mRNA,参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。控制着包括动、植物器官形成、发育、代谢以及某些疾病的发生。
[0003] miRNA以不完全配对方式与靶基因相结合，这种不完全配对模式使得miRNA及其靶基因的调控网络非常复杂，即一条miRNA可以同时作用若干甚至上百个功能基因，一个功能基因也可能受高达数十条miRNA所调控。很难通过分子生物学实验加以一一验证。Bartel等（Friedman,R.C.,K.K.Farh,C.B.Burge,and D.P.Bartel.2009.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.Genome Res19:92-105）研究发现miRNA的5’端第2-8个碱基的种子序列与靶基因序列精确配对，基于这一结合特性相续开发出了一系列miRNA靶基因生物信息学预测软件。
[0004] 寻找miRNA的靶基因的方法主要分为生物信息学方法和生物学实验方法。生物学实验方法获得数据较为准确，其缺点是一次只能证明一条靶基因，通量不够。生物信息方法获得数据通量较大，但准确率较低。两种方法各有特点但都必须有一个硬性前提，即所分析物种的基因组信息需较为完整。绵羊基因组虽已发布第二版（V2.0），第四版至今没有公布，参见官方测序网站（http://www.animalgenome.org/sheep/），由于版本较低，测序质量不高，存在很多没有测通的片段（gap），基因组数据不够完整，大量基因的3’UTR序列未知。因此利用以上两种方法很难批量获得绵羊骨骼肌miRNA及其靶基因调控网络的完整信息。
[0002]
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种获取miRNA候选靶基因的方法、获取
miRNA与mRNA的候选结合位点的方法及其专用反转录引物。[0006] 本发明所提供的获取miRNA候选靶基因的方法，包括：[0007] 1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG
且能值低于-30.00kcal/mol；所述miR-X是所述含量为57-62%，环部不配对碱基数≤6个，
目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱
[0005]
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氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；[0008] 2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；[0009] 3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。[0010] 本发明所提供的获取miRNA与mRNA的候选结合位点（候选结合区）的方法，包括：[0011] 1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57-62%，环部不配对碱基数≤6个，且能值低于-30.00kcal/mol；所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；[0012] 2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；[0013] 3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA与mRNA的候选结合位点；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序
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列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。
[0014] 上述方法中，所述mRNA对应的cDNA第一条链是指由所述mRNA反转录得到的cDNA第一条链。所述引物A1和所述所述引物B1均为单链DNA。
上述方法中，所述真核生物目的组织具体可为羊、猪或牛骨骼肌，所述目的miRNA
可为在骨骼肌中表达的miRNA。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述真核生物目的组织为羊骨骼肌，所述反转录引物A的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X，其中miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述引物A1的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG；和/或，[0017] 所述反转录引物B的核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT，其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA为特异接头的核苷酸序列，所述引物B1的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT（其与特异接头序列中的黑体部序列同向互补）。[0018] 生物信息学比对结果表明所述反转录引物A、所述引物A1、所述反转录引物B、所述引物B1也可用于构建牛和猪骨骼肌中的miRNA的候选靶基因文库。[0019] 在本发明的一个实施例中，所述目的miRNA是mir-133，其3′至5′方向的核苷酸序列为GUCGACCAACUUCCCCUGGUUU，所述反转录引物A的5′至3′方向的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGCCCCTGGTTT。[0020] 上述方法中，当所述反转录引物A的茎环结构的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG，所述反转录A可在37-42℃（如42℃）进行，此温度下，茎环处序列呈二级结构状态，只有种子序列成单链状态，可以特异性进行反转录，最大程度保证了目的基因反转录的保真性；所述合成所述A库的cDNA第二条链在15℃～25℃（如16℃）进行。
[0021] 上述方法中，当所述引物A1的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG，所述引物B1的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT，所述步骤3中，所述扩增为PCR扩增，所述PCR扩增采用的引物退火条件为65℃退火30s。进一步，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为：94℃预变性1min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2-3min，30个循环；72℃延伸10min。
[0015]
上述获取miRNA的候选靶基因的方法可用于构建获取miRNA候选靶基因的文库。
[0023] 上述方法中所述的反转录引物A也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明还要求保护用于获取miRNA候选靶基因的成套反转录引物。[0025] 该用于构建miRNA的候选靶基因文库的成套反转录引物，由独立包装的上述方法中所述的反转录引物A和上述方法中所述的反转录引物B组成。
[0026] 本发明还要求保护如下用于获取miRNA候选靶基因的成套引物：由独立包装的上述方法中所述的反转录引物A、上述方法中所述的引物A1、上述方法中所述的反转录引物B和上述方法中所述的引物B1组成。
[0022]
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说 明 书
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本发明可用于大批量获取真核生物目的组织中所表达的miRNA的候选靶基因，采
用核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X的反转录引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反转录引物B可以获得绵羊、猪、牛所表达的miRNA的候选靶基因，为家畜骨骼肌功能基因相关研究提供基因信息，所获得的关键靶标基因将可直接运用于肉羊、肉猪和肉牛分子育种。本发明的方法特别适合于构建哺乳动物各组织miRNA候选靶基因文库。附图说明
[0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039]
图1为反转录引物A的结构。图2为本发明的原理图。
图3为阳性PCR产物的电泳结果。图4为mir-133的候选靶基因序列。图5为Myog1的序列。图6为Myog2的序列。
图7为双荧光检测mir-133的候选靶基因结果。图8为Myog基因全靶标序列。
图9为Big-pri-miR-133b的DNA序列。图10为pri-miR-133b的DNA序列。图11为pri-miR-133a-1的DNA序列。图12为pri-miR-122的DNA序列。
具体实施方式
[0040] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0042] 可采用图1所示的反转录引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反转录引物B（带下划线的序列为特异接头）、核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG的引物A1、核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT的引物B1构建于羊、牛、和猪的骨骼肌miRNA的候选靶基因文库。反转录引物A的茎环结构的茎颈部完全配对，结构稳定，能够保证在反转录时茎颈部呈双链状态，只允许10碱基的种子序列区可以特异性地捕获靶标基因序列。反转录引物A的茎环结构（核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG）是发明人经历数次实验验证证明效果最佳，优于同类茎环结构，其序列不同于任何报道文献，能值较低，结构非常稳定。其效果见表1。[0043] 表1.茎环结构
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说 明 书
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表1不同部分序列组合的茎环引物优劣比较，其中4为文献已发表的茎环
结构引物（Volinia S,Calin GA,Liu CG,et al.A microrna expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(7):2257-2261）。
[0046] 图1中XXXXXXXXXX为目的miRNA种子序列，为10个核苷酸，反转录时基因特异性要优于种子序列为8个核苷酸的反转录引物。[0047] 如图2所示，以图1所示的反转录引物A为反转录引物钓取与目的miRNA种子序列相互补的靶基因构建A库；再以带特异接头的15个胸腺嘧啶（T（15））的反转录引物B获取全部骨骼肌中表达的功能基因（mRNA）构件B库；并用商业化的Cocktail酶分别合成A、B库cDNA第二链DNA得到A′库和B′库；再分别将A′库和B′库双链DNA进行杂交；最后利用引物A1和引物B1扩增功能基因的序列信息。在该DNA扩增反应中，只有含引物A1和引物B1的DNA才能够指数倍扩增，其他含有单引物的扩增反应均为线性扩增，本环节会大量富集带引物A1和引物B1的基因片段。
[0048] 下面以在绵羊骨骼肌中表达的miRNA（mir-133）为例，阐明本发明的获取家畜miRNA的候选靶基因的方法。[0049] 实施例1、获取名称是mir-133的miRNA候选靶基因[0050] 本实施例采用的miRNA是mir-133，其3′至5′方向的核苷酸序列为GUCGACCAACUUCCCCUGGUUU。反转录引物A的5′至3′方向的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGCCCCTGGTTT（带下划线碱基为mir-133种子序列）。反转录引物B的核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT。引物A1的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG，引物B1的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT。其中，引物A1和引物B1为巢式引物。[0051] 具体方法如下：
[0052] 使用商业化Trizol试剂提取绵羊（中国美利奴细毛羊）骨骼肌总RNA，并使用Oligotex mRNA纯化试剂盒子纯化骨骼肌总RNA。将纯化的总mRNA分成两等份（分别标记为M和N），分别进行下述的操作。[0053] 1、采用promega反转录试剂盒子（货号为：M5108）以反转录引物A对M等份的绵羊
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骨骼肌总mRNA进行反转录，获取与mir-133种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库。
[0054] 具体方法如下：[0055] A库第一链合成
[0056] mRNA(2μg) 2-4μL[0057] 反转录引物A（10μM） 1μL[0058] 加入无菌水至终体积5μL混匀内容物，短暂离心；[0059] 在PCR仪中70℃保温2min；[0060] 冰上速冷2min；[0061] 短暂离心；
[0062] 向管中加入以下成分：
[0063] 5x第一链合成缓冲液 2μL[0064] dNTP混合物（各10mM） 1μL[0065] 无菌水 1μL[0066] AMV反转录酶（20u/μL） 1μL轻柔振荡混匀，短暂离心；[0068] 在空气孵箱中42℃孵育1.5h；
[0069] 将反应管置于冰中以终止cDNA第一链合成。[0070] 2、采用promega反转录试剂盒子（货号为：M5108）以反转录引物B对N等份的绵羊骨骼肌总mRNA进行反转录，获取绵羊骨骼肌总mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；具体方法如下：
[0071] B库第一链合成:
[0072] mRNA(2μg) 2-4μL[0073] 反转录引物B（10μM） 1μL[0074] 加入无菌水至终体积5μL混匀内容物，短暂离心；[0075] 在PCR仪中70℃保温2min；[0076] 冰上速冷2min；[0077] 短暂离心；
[0078] 向管中加入以下成分：
[0079] 5x第一链合成缓冲液 2μL[0080] dNTP混合物（各10mM） 1μL
[0081] 无菌水 1μL[0082] AMV反转录酶（20u/μL） 1μL[0083] 轻柔振荡混匀，短暂离心；[0084] 在空气孵箱中42℃孵育1.5h；
[0085] 将反应管置于冰中以终止cDNA第一链合成。
[0067]
3、利用Clontech公司的抑制性消减杂交试剂盒（型号:637401）合成所述A库的
cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库。对A、B库第一链cDNA分别进行如下操作：
[0086]
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[0087] （1）将以下试剂冰浴，然后加入第一链合成反应管中：
5x第二链缓冲液 16.0μL[0089] dNTP混合物（每种10mM） 1.6μL[0090] 20x第二链酶混合物（cocktail） 4.0μL[0091] （2）补双蒸水至80μL，混合均匀，短暂离心；
[0088]
[0092] （3）16℃孵育2h后加入2μL（6U）T4DNA聚合酶，充分混匀，16℃孵育30min；[0093] （4）加入4μL20x EDTA/糖原混合物以终止第二链合成；
[0094] （5）采用酚仿法抽提双链DNA，纯化后的A′、B′库DNA溶于20μL ddH2O。
4、将步骤3的A′库和B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所得到杂交DNA分子为模板用，引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段。具体方法如下：[0096] 杂交：将A′、B′库DNA等体积混合后，置于PCR仪器上95℃作用10min，50℃作用5分钟，得到A′库和B′库杂交产物（杂交DNA分子），常温保存。[0097] PCR反应体系如表2：[0098] 表2.PCR反应体系
[0095] [0099]
成分
A′库和B′库杂交产物10x PCR缓冲液引物A1（10μM）引物B1（10μM）dNTP混合物（10mM）
每反应的数量（μL）15.01.01.04.0
50x Advantage2聚合酶混合物1.0补ddH2O至
[0100]
50.0
PCR反应温度程序：
[0102] 94℃预变性1min；[0103] 94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2-3min，30个循环；[0104] 72℃延伸10min。[0105] 5、将步骤4扩增的PCR产物连接T载体，或直接进行高通量测序。本实验以连接T载体为例。
[0106] 按照TaKaRa公司pMD-19-T vector载体试剂盒说明进行目的基因片段与T easy载体连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，然后进行氨苄青霉素抗性筛选；挑选白色菌落利用引物A1和引物B1进行菌落PCR鉴定。PCR扩增反应体系如下：
[0101]
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10×PCR Buffer 2.5μL
[0108] dNTP Mix（2.5mM） 2μL[0109] 引物A1(10mM) 0.5μL[0110] 引物B1(10mM) 0.5μL[0111] Taq DNA聚合酶（2.5U/μL） 0.5μL[0112] ddH2O 19μL[0113] 总体积 25μL。
[0114] PCR反应温度程序同步骤4。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，阳性PCR产物的电泳结果如图3所示。图3中的DNA分子marker为Takara公司的DL2000。总共得到1853个PCR阳性且片段大小不同的阳性菌落。根据PCR产物获取mir-133的候选靶基因。[0115] 采用天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒（货号：DP106-02）提取其中10个经菌落PCR鉴定为阳性且片段大小不同的阳性菌落（可以有效去除重复基因的克隆）的质粒，直接送北京六合华大基因进行测序。[0116] 测序结果表明，其中一个PCR产物是已经被证明为mir-133的靶基因（The role of microRNA-1and microRNA-133in skeletal muscle proliferation and differentiation[J].Nature genetics,2006,38(2):228-233），其序列如图4所示，其中划线部分是与miR-133的种子序列以一个碱基（波浪线示）差别的不完全配对方式相结合，其特征符合miRNA结合功能基因的特点。
其余9个PCR产物来自新的mir-133的候选靶基因，其中有2个PCR产物均来自
Myog（Myogenin）基因，其和miR-133的潜在结合位点一处位于终止密码子下游的510bp处（将该PCR产物命名为Myog510），另一处位于终止密码子下游的648bp处（将该PCR产物命名为Myog648）。我们挑选Myog510和Myog648进行细胞学验证，研究结果表明miR-133可以有效地结合Myog510。
[0118] Myog510的序列如图5（SEQ ID No.1），其中划线部分与miR-133的种子序列完全配对方式相结合，其中有两处（波浪线处）允许G-U配对方式与miR-133相结合。[0119] Myog648的序列如图6（SEQ ID No.2），其中划线部分与miR-133的种子序列以一个碱基差别（波浪线处）的不完全配对方式相结合，其中有3处为G-U配对方式与miR-133相结合。
[0120] 为了验证miR-133与Myog基因的结合能力，是结合510处还是结合648处，还是同时结合两处。设计如下实验。
[0121] 首先将Myog基因全靶标序列（全序列见图8，以绵羊耳朵基因组DNA为模板，用引物Myog target-XhoⅠF：CCGCTCGAGTTCCCAGATGAAACCATAC和Myog target-NOTⅠR：AAAGCGGCCGCTCTAGCACCCAGTCTTTAT扩增得到，引物5’端前3个碱基为保护性碱基，其后6个下标红线的碱基为酶切位点，再次为Myog基因序列）插入到双荧光酶报告载体psiCHECKTM-2（购自Promega公司，货号：C8021）的XhoⅠ和NOTⅠ位点间得到重组载体psiCHECK-Myog。将Myog510核心序列四倍串联重复体（图8中510核心位置序列（带双直下划线碱基）重复4遍）插入到psiCHECKTM-2的XhoⅠ和NOTⅠ位点间得到重组载
[0117]
体psiCHECK-510，将Myog648核心序列五倍串联重复体（图8中648核心位置序列（带波浪下划线碱基）重复5遍）插入到psiCHECKTM-2的XhoⅠ和NOTⅠ位点间得到重组载体
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psiCHECK-648。
[0122] Myog510核心序列四倍串联重复体是将四个图8中带双直下划线碱基所示的510处核心序列串联得到的DNA分子，用如下引物获得：510target 1st forward：[0123] atctgTAATCCAGTTCCCAAGTCACTGGGGGGGCCAAGCTATTatctg、510target 1st reverse：cagatAATAGCTTGGCCCCCCCAGTGACTTGGGAACTGGATTAcagat、510target 2nd forward：atctgTAATCCAGTTCCCAAGTCACTGGGGGGGCCAAGCTATTatctgTAATCCAGTTC、510target2nd reverse：cagatAATAGCTTGGCCCCCCCAGTGACTTGGGAACTGGATTAcagatAATAGCTTGGC，其中划横线部分为miR-133种子序列结合区）。
[0124] Myog648核心序列五倍串联重复体将五个图8中带波浪下划线碱基所示的648处核心序列串联得到的DNA分子，用如下引物获得：648target1st forward：[0125] atctgAGGGATAGGTGCGGGGCGGGGGGCAGGGGCTCatctg、648target1st reverse：[0126] cagatGAGCCCCTGCCCCCCGCCCCGCACCTATCCCTcagat、648target2nd forward：
[0127] atctgAGGGATAGGTGCGGGGCGGGGGGCAGGGGCTCatctgAGGGATAGGTGCGGGGC、648target2nd reverse：cagatGAGCCCCTGCCCCCCGCCCCGCACCTATCCCTcagatGAGCCCCTGCCCCCCGC，其中划线部分为miR-133结合位点）插入到psiCHECKTM-2的XhoⅠ和NOTⅠ位点间得到重组载体psiCHECK-648。
其中，Myog510核心序列四倍串联重复体和Myog648核心序列五倍串联重复体的
引物中，带有“1st”的序列为人工合成的序列，带forward和reverse的DNA退火后形成双链，并以此为模板，以带有“2nd”的序列为上下游引物进行PCR扩增，扩增后的产物即为510和648各自重复体，重复子的数目范围为1～N（N为正整数），小写字母“atctg”与“cagat”为人造间隔序列。
[0129] miRNA表达载体的构建：分别扩增miR-133b大前体片段Big-pri-miR-133b（以绵羊基因组为模板，Big-Pri-miR133b-Nhe F和Big-Pri-miR133b-Nhe R为引物扩增得到）、miR-133b前体片段pri-miR-133b（以绵羊基因组DNA为模板，Pri-miR133b-NheF和Pri-miR133b-Nhe R为引物）、miR-133a-1前体片段pri-miR-133a-1（以绵羊基因组为模板，Pri-miR133a-1-Nhe F和Pri-miR133a-1-Nhe R为引物扩增得到）和miR-miR-122前体pri-miR122（以绵羊基因组为模板，Pri-miR122-Nhe F和Pri-miR122-Nhe R为引物扩增得到）；再使用NheⅠ和EcoRⅠ内切酶分别酶切以上PCR产物和pIRES2-EGFP（Clontech公司，C6029-1）载体，将PCR双酶切产物分别与载体双酶切回收产物进行连接构建表达载体，得到含有Big-pri-miR-133b的表达载体pIRES2-Big-pri-miR133b、含有pri-miR-133b的表达载体pIRES2-pri-miR133b、含有pri-miR-133a-1的表达载体pIRES2-pri-miR133a1和含有pri-miR122的阴性对照表达pIRES2-pri-miR122载体。[0130] 其中，Big-pri-miR-133b的DNA序列如图9（图9中带波浪下划线碱基为成熟体miR-133序列），pri-miR-133b的DNA序列如图10（图10中带波浪下划线碱基为成熟体miR-133序列），pri-miR-133a-1的DNA序列如图11（图11中带波浪下划线碱基为成熟体miR-133a-1序列），pri-miR122的DNA序列如图12（图12中带波浪下划线碱基为成熟体miR-122序列）。
[0128]
引物信息如下：
[0132] Big-Pri-miR133b-NheⅠF:ATAGCTAGCAATGCCAGCTCCTTCTGTGT[0131]
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Big-Pri-miR133b-EcoRⅠR:CCGGAATTCTCACTTGTGAAGCCAGGGCT[0134] Pri-miR133b-Nhe F:ATAGCTAGCGATGCTCGGGACACACCAAGAAT[0135] Pri-miR133b-EcoRⅠR:CCGGAATTCAACGGTAGTAGGTACTTTCAGCC[0136] Pri-mir133a-1-Nhe1F:ATAGCTAGCTCCAGACGTCACCCAGAAGC[0137] Pri-mir133a-1-EcoRⅠR:CCGGAATTCTGGCCGAGCTGGCCTGAGTG[0138] 阴性对照用于对照的pri-miR-122的引物：
[0139] Pri-miR122b-Nhe F:ATAGCTAGCTGATGCTCAGAGACTCTGGT[0140] Pri-miR122b-EcoRⅠR:CCGGAATTCAGATGAACTTTCCTGCCCAC。[0141] 培养Hela细胞，将psiCHECK-Myog、psiCHECK-510和psiCHECK-648分别与pIRES2-Big-pri-miR133b、pIRES2-pri-miR133b、pIRES2-pri-miR133a1和pIRES2-pri-miR122载共转Hela细胞，48小时后收集细胞，按照双荧光检测试剂盒
Luciferase Assay System操作指南检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的荧
光比值（Renilla/firefly的比值），Renilla荧光素酶下降时表示过表达的miR-133能够很好的结合靶标基因。见实验结果图。实验重复3次，试验所有数据采用SPSS12.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。
[0142] 结果表明共转psiCHECK-Myog和pIRES2-Big-pri-miR133b的HeLa细胞、共转psiCHECK-Myog和pIRES2-pri-miR-133b的HeLa细胞中，海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的荧光比值与空白对照（blank，该组只转染荧光素酶空质粒）相比均显著下降，说明过表达载体生成的成熟miR-133b能够对psiCHECK-Myog载体表达的海参荧光素酶有抑制作用，造成海肾荧光素酶的降解，而内对照的萤火虫荧光素表达没有发生变化；共转psiCHECK-510和pIRES2-Big-pri-miR-133b的HeLa细胞、共转psiCHECK-510和pIRES2-pri-miR-133b的HeLa细胞中，海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的荧光比值与空白对照（blank，该组只转染荧光素酶空质粒）相比均显著下降，说明过表达载体生成的成熟miR-133b能够对psiCHECK-510载体表达的海参荧光素酶有抑制作用，造成海肾荧光素酶的降解，而内对照的萤火虫荧光素表达没有发生变化。而共转psiCHECK-648和pIRES2-Big-pri-miR-133b的HeLa、共转psiCHECK-648和pIRES2-pri-miR-133b的HeLa中，海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的荧光比值（blank，该组只转染荧光素酶空质粒）相比均无显著差异，证明Myog基因3’UTR上510靶位点能够被miR-133结合的效率较648处结合紧密。表明Myogenin是miR-133的候选靶基因。[0143] 图7中，第一个柱状图为pIRES2-Big-pri-miR133b和psiCHECK-Myog共转染Hela细胞的结果；第二个柱状图为pIRES2-pri-miR133b和psiCHECK-Myog共转染Hela细胞的结果；第三个柱状图为pIRES2-pri-miR122和psiCHECK-Myog共转染Hela细胞的结果；第四个柱状图为pIRES2-pri-miR133a1和psiCHECK-Myog共转染Hela细胞的结果；第五个柱状图为仅psiCHECK-Myog转染Hela细胞的结果，第六个柱状图为pIRES2-Big-pri-miR133b和psiCHECK-510共转染Hela细胞的结果；第七个柱状图为pIRES2-pri-miR133b和psiCHECK-510共转染Hela细胞的结果；第八个柱状图为pIRES2-pri-miR122和psiCHECK-510共转染Hela细胞的结果；第九个柱状图为pIRES2-pri-miR133a1和psiCHECK-510共转染Hela细胞的结果；第十个柱状图为仅psiCHECK-510转染Hela细胞的结果，第11个柱状图为pIRES2-Big-pri-miR133b和psiCHECK-648共转染Hela细胞的
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结果；第12个柱状图为pIRES2-pri-miR133b和psiCHECK-648共转染Hela细胞的结果；第13个柱状图为pIRES2-pri-miR122和psiCHECK-648共转染Hela细胞的结果；第14个柱状图为pIRES2-pri-miR133a1和psiCHECK-648共转染Hela细胞的结果；第15个柱状图为仅psiCHECK-648转染Hela细胞的结果，第16个柱状图为背景对照，即不转染加任何质粒的HeLa细胞检测荧光值比值（**:P<0.01；*:P<0.05）。
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