杨明珍等小鼠ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞体外扩增第２期 ・１Ｏ９・ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４８４Ｘ．２０１２．０２．００３ 小鼠ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞体外扩增 杨明珍刘飞宋玲刘蒙夏雷鸣 （安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥２３００２２） 中国图书分类号［摘Ｒ３９２．４ 文献标识码Ａ 文章编号１０００－４８４Ｘ（２０１２）０２－０１０９－０５ 要］ 目的：本研究旨在探讨ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞体外扩增的方法。方法：采用磁珠分选小鼠ＣＤ４ Ｔ 细胞，ｃｔＣＤ３单克隆抗体包被２４孔板，加入￣ＣＤ２８单克隆抗体、雷帕霉素、ｒｈｌＬ一２，培养３周后，流式细胞仪测定培养细胞中 ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞的含量，实时定量ＰＣＲ检测ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的表达；单向混合淋 巴细胞反应和增殖抑制 试验测定扩增的ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔ细胞的增殖及其抑制功能；ＥＬＩＳＡ检测培养上清中ＩＬ一１０和ＴＧＦ一３１１的含量。结果：小鼠ＣＩＭ Ｔ细胞培养３周后，ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞达（７６．０５ ４－２．７３）％，高于未加雷帕霉素组（５２．１７ ４－１．３６）％（Ｐ＜０．００１），磁珠分选的 ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的表达是未加雷帕霉素组的５倍（Ｐ＜０．００１），增殖能力是未加雷帕霉素组的０．２９倍（Ｐ＜ ０．００１），对ＣＩＭ Ｔ细胞增殖抑制能力是未加雷帕霉素组的３．６倍（Ｐ＜０．００１），培养上清中ＩＬ一１０和ＴＧＦ－１３１分别是对照组的 １．８倍和１．６倍（Ｐ＜０．００１）。结论：小鼠ＣＤ４ Ｔ细胞在含有１ ｇ／ｍｌ的ａＣＤ２８、ｒｈｌＬ－２ １００ Ｕ／ｍｌ和终浓度为１０ ｎｍｏｌ／Ｌ雷帕 霉素的培养体系中培养３周后能有效扩增ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞。 ［关键词］雷帕霉素；ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞；ＩＬ一１０；ＴＧＦ一３１１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ—Ｚｈｅｎ，ＨＵ Ｆｅｉ，ＳＯＮＧ ｎｎｇ，ＵＵ Ｍｅｎｇ，ＸＩＡ Ｌｅｉ—Ｍ ｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＡｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｈｃｆｅｉ ２３００２２，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈ－ ’ ｏｄｓ：ＣＩＭ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｏｕｓｅ ｓｐｌｅｅｎ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳ，ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ２４ ｗｅｌｌｓ ｐｌａｔｅ ｆｏｒ ３ ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅ ｐｌａｔｅ ｗａｓ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔＣＤ３ ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ａＣＤ２８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｒｈＩＬ－２ ａｎｄ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｗｉｔｈ ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ １５％ＦＢＳ，ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ３７％，５％ＣＯ２ ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ．Ａｆｔｅｒ ３ ｗｅｅｋｓ，ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＦＣＭ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ＭＬＲ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘａｍ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＩＬ一１０ ａｎｄ ＴＧＦ一１３１ ｏｆ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅ・ ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｉｔ ｗａｓ（７６．０５ ４－２．７３）％，ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（５２．１７ ４－１．３６）％（Ｐ＜０．００１），ｔｈｅ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ ｏｆ ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｒｏｕｐ ｇｗａｓ ５ ｆｏｌｄｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｐ＜０．００１），ｔｈｅ ａｂｉｌｉ— ｔｙ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．２９ ｆｏｌｄｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｐ＜０．００１），ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｏ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ３．６ ｆｏｌｄｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｐ＜０．００１），ｔｈｅ ＩＬ一１０ ｏｆ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ １．８ ｆ０ｌｄｓ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｄ ＴＧＦ一３１１ ｏｆ ｓｕｐｅｍａｔｎｔａ ｗａｓ １．６ｆｏｌｄｓ ｈｉｈｅｒｔｇｈａｎｔｈｅ ｇｒｏｕｐｗｉｔｈｏｕｔＲａｐａｍｙｅｉｎ（Ｐ＜０．００１）．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ：Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇｓｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐａｎｄ－ ｅｄ 山ｏｔＣＤ３．ｃｔＣＩＹ２８．ｒｈＩＬ－２ ａｎｄ Ｒａｐａｍｙｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｒａｐａｍｙｅｉｎ；ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ ｒｅｕｌｇａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｏｗｔｇｈ ｆａｃｔｏｒ １３１ 调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ细胞）是 一ＣＤ４ ＣＤ２５ ｈｉｇｈＴｒｅｇ细胞的数量与异基因造血干细胞 种具有免疫调节和抑制功能的Ｔ细胞，１９９５年由 移植后急性移植物抗宿主病密切相关 Ｊ。多项研 究报道Ｔｒｅｇ细胞能够诱导效应Ｔ细胞无能或凋亡， 减轻移植排斥反应，在器官移植的生物治疗中发挥 重要作用。由于ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇ细胞数量 Ｓａｋａｇｕｃｈｉ等 首次报道。天然ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ 细胞特异性表达转录因子Ｆｏｘｐ３，常采用ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞作为ＣＩＭ ＣＤ２５ ｈｉｇｈＴｒｅｇ细胞的 标志 Ｊ。这群细胞具有免疫无能性和免疫抑制性， 在维持机体免疫稳定等方面具有重要作用，而且 很少，限制其Ｉ临床使用，建立可靠的体外扩增方法是 开展ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇ细胞治疗的前提。本 文报道通过免疫磁珠分选技术，采用雷帕霉素（Ｒａ— 作者简介：杨明珍（１９６４年一），男，博士，主任医师，硕士生导师，主要 从事造血干细胞移植及移植免疫研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｍｚ８９＠ ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ。 ｐａｍｙｃｉｎ，ＲＡＰＡ）选择性体外扩增ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇ细胞，对扩增的Ｔｒｅｇ进行表型和功能 ・ｌｌＯ・ 鉴定。 １材料与方法 １．１实验动物８～１０周龄的ＳＰＦ级Ｃ ＢＬ／６小 鼠（Ｈ－２ｂ，６），体重１８～２２克，８～１０周龄ＳＰＦ级 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（Ｈ．２ｄ，６），体重２０～２４克，由上海实 验动物中心提供（证书编号２００１Ｂ０２５），饲料及垫料 均经∞ｃｏ辐照处理，饮用水高温高压灭菌处理，在苏 州大学实验动物中心层流房中饲养。 １．２ 主要试剂 小鼠ａＣＤ３单克隆抗体和小鼠 ｏｔＣＤ２８单克隆抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），ＰＥ－ｃｙ５仓鼠抗小 鼠ＣＤ４单抗、ＦＩＴＣ．大鼠抗小鼠ＣＤ２５单抗和ＦＩＴＣ 大鼠的ＩｇＭ（同型对照，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），ｒｈｌＬ一２（厦 门特宝生物制品公司），雷帕霉素（ＲＡＰＡ，Ｓｉｇｍａ）， 小鼠ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞磁珠分选试剂盒（Ｍｉｈｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ），／Ｊ、鼠ＩＬ一１０ ＥＬＩＳＡ试齐０盒（Ｒ＆Ｄ），／Ｊ、鼠 ＴＧＦ一１３１ ＥＬＩＳＡ试剂盒（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ），Ｔｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎ— ｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｍ－ＭＬＶ（ｐｒｏｍｅｇａ），ｄＮＴＰ（上海生工生物 工程技术公司），ＣＣＫ一８试剂盒（日本同仁化学研究 所），ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ）。 １．３主要仪器Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏ－ ｔｅｃ），流式细胞仪（ＥｐｉｃｓＸＬ２型，Ｂｅｃｋｍａｎ・Ｃｏｕｌｔｅｒ）， 实时定量ＰＣＲ仪（ＭＪ Ｏｐｔｉｏｎ ２型，ＭＪ ＲｅｓｅａｒＣｈ Ｉｎｃ．），ＰＣＲ扩增仪（东胜创新生物科技有限公司）， 全自动酶标仪（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）。 １．４实验方法 １．４．１ ＣＤ４ Ｔ细胞的分选严格按照操作说明进 行。采用颈脱臼法处死Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，剪开腹腔， 在无菌条件下取出小鼠脾脏。制备脾细胞悬液，红 细胞裂解液裂解红细胞，按照小鼠ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ 细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作，通过流式细 胞仪分析获得的ＣＤ４ 细胞纯度。用含１０％ＦＢＳ的 ＲＰＭＩ１６４０完全培养基洗涤细胞２次，并用ＲＰＭＩ１６４０ 完全培养基调细胞浓度为１×１０。ｍｌ～，用于后续的 培养。 １．４．２ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞的体外扩增及磁珠分选 将ｃｔＣＤ３单抗溶于灭菌的ＰＢＳ中，浓度为２ ｇ／ ｍｌ，加入２４孔培养板中，１ ｍｌ／￣Ｌ，４￣Ｃ冰箱中过夜。 次日吸出ｅｔＣＤ３单抗，用ＲＰＭＩ１６４０完全培养基冲 洗培养板２次。每孔加入１ ｍｌ（１０。ｍｌ 细胞） ＣＤ４ Ｔ细胞悬液，１ ｇ／ｍｌ ｅｔＣＤ２８单抗，共２４孑Ｌ，分 为Ｒ Ｔｒｅｇ组、Ｒ—Ｔｒｅｇ组。Ｒ Ｔｒｅｇ组１８孔，加入 ＲＡＰＡ，终浓度为１０ ｎｍｏｌ／Ｌ，Ｒ—Ｔｒｅｇ组６孔，不加 ＲＡＰＡ，培养３个周期，每个周期为７天，第二个周期 开始加入ｒｈＩＬ．２ １００ Ｕ／ｍｌ。每个周期结束后流式细 中国免疫学杂志２０１２年第２８卷 胞仪检测每组ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞的比例，３周培养 结束后收集细胞及培养上清。按照小鼠ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ细胞磁珠分离试剂盒说明书进行ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞的分选。 １．４．３ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的实时定量ＰＣＲ检测 提取总 ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ，置一２０℃保存备用。小鼠Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的实时定量ＰＣＲ的引物、探针、质粒标准品制备 以及实时定量ＰＣＲ检测按文献［８］所述操作。 １．４．４单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验 反应细胞：磁珠分选的Ｃ ＢＩＭ６小鼠脾细胞获得的 ＣＤ４ Ｔ细胞，Ｒ Ｔｒｅｇ组和Ｒ—Ｔｒｅｇ组细胞；刺激细 胞：经３ＯＧｙ照射后的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞。用 ＲＰＭＩ１６４０完全培养基调整细胞浓度为５× １０ ｍｌ一，反应细胞：滋养细胞为１：２，加入９６孔板 中，每个实验组分别做３个复孔，对照孔只加反应细 胞，不加滋养细胞，本底只加培养基，３７￣Ｃ ５％ＣＯ 饱和湿度条件下培养５天，每孔加入ＣＣＫ一８ １０ ｌ， 继续培养４小时，置酶标仪读取ＯＤ 如值（Ａ）。根据 公式计算刺激指数：刺激指数＝Ａ（实验孔一对照孔）／Ａ（对照 孔一本底孔）×１００％。 增殖抑制试验：在与上述混合淋巴细胞反应类 似的体系中，在ＣＩＭ Ｔ细胞孔中分别加入２：１的 Ｒ Ｔｒｅｇ细胞和Ｒ—Ｔｒｅｇ细胞，均做３个复孔。３７℃ ５％ＣＯ 饱和湿度条件下培养７２小时后，每孔加人 ＣＣＫ一８ ｌ０ ｌ，继续培养４小时，置酶标仪读取ＯＤ 。 值（Ａ）。根据公式计算抑制率，抑制率＝Ａ（对照孔一实验 孑Ｌ）／Ａ（对照孑Ｌ一本底）×１００％。 １．４．５ ＩＬ一１０和ＴＧＦ．Ｂ的检测采用ＥＬＩＳＡ方法检 测培养上清中ＩＬ一１０和ＴＧＦ一１３１的含量，比较Ｒ Ｔｒｅｇ组和Ｒ—Ｔｒｅｇ组培养上清中上述两种细胞因子 的差异。采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，严格按照小鼠 ＩＬ．１０和ＴＧＦ一１３１ ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书操作。 １．５统计学处理 以上各组实验至少独立重复三 次，数据以ｙ－±ｓ表示，结果采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件 进行统计学处理。两组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜ ０．０５为差异有显著性。 ２结果 ２．１ ＣＤ４ Ｔ细胞的分选 小鼠脾细胞分选前 ＣＤ４ Ｔ细胞占脾细胞的１９．８％，经磁珠分选后 ＣＤ４ Ｔ细胞纯度高于９５％，见图１。 ２．２ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞体外扩增ＣＤ４ Ｔ细胞经 过ｄＣＤ３、 ＣＤ２８、ＩＬ－２和ＲＡＰＡ联合刺激培养３个 周期，每一周期为７天，在每一个周期结束时进行流 式检测ＣＤ４和ＣＤ２５的表达，结果见表１和图２。 杨明珍等小鼠ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞体外扩增第２期 图１分选前后ＣＤ４ Ｔ细胞占脾细胞的百分比 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｏｒｔｉｎｇ Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｂｅｆｏｒｅ ｓｏｒｔｉｎｇ；Ｂ．Ａｆｔｅｒ ｓｏｒｔｉｎｇ． 表１ ＲＡＰＡ对ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞体外扩增的结果 （ －ｉ－Ｓ）％ Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｔｈ ＲＡＰＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ ±Ｓ）％ Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜０．０５，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｒ—ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｒｅｅ ｗｅｅｋｓ． Ｂｅｆ￣ ｒｅ ｃｕｌｍｒｅ Ｒ－Ｔｒｅｇ 誊－ －豢 潼 委 ＣＤ４ＰＣ５ 图２培养３周后ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞流式检测 Ｆｉｇ．２ ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＦＣＭ ａｆｔｅｒ ｃｕｌ・ ｔｕｒｅ ｔｈｒｅｅ ｗｅｅｋｓ １０４ １０ｅ 图３磁珠分选ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞（Ａ）和ＣＤ４ ＣＤ２５一Ｔ 细胞（Ｂ） Ｆｉｇ．３ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ（Ａ）ａｎｄ ＣＤ４ ＣＤ２５一Ｔ ｃｅｌｌｓ （Ｂ）ｓｏｒｔｅｄ ｂｙ ＭＡＣＳ ｂｅａｄ ２．３ ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔ细胞的磁珠分选经３周体外 培养后，分选Ｒ Ｔｒｅｇ细胞和Ｒ—Ｔｒｅｇ细胞，阳性选 择的ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞纯度为９５％以上，阴性选 表２实时定量ＰＣＲ检测培养３周Ｔｒｅｇ细胞Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ 结果 Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｒｅｅ ｗｅｅｋｓ Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜０．０５，ｔｈｅ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｒ—Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ． ．表３培养７２小时单向混合淋巴细胞反应结果（２－±Ｓ） Ｔａｂ．３ Ｏｎｅ－ｗａｙ ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ７２ ｈｏｕｒｓ（ ±Ｓ） Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜０．０５．Ｉｔ ｗａｓ ｓｉｎｇｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ＣＩＭ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｒ—Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ． 表４培养上清中ＩＬ－１０和ＴＧＦ－阻含量（ ± ） Ｔａｂ．４ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＩＬ－１０ ａｎｄ ＴＧＦ・１３１ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＩＬ－１０ ａｎｄ ＴＧＦ－Ｂｌ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｒ—Ｔｒｅｇ ｇｒｏｕｐ． 择的ＣＤ４ ＣＤ２５一Ｔ细胞纯度为９９％，见图３。阳性 选择的ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞用于后续的实验。 ２．４ Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的实时定量ＰＣＲ检测将１Ｏ倍 系列稀释的质粒标准品，用建立的该方法测定，结果 显示本方法具有较好的检测灵敏度（１０ ｃｏｐｉｅｓ／￣１）。 ｃｔ值和模板起始拷贝数的对数ｌｇ值之间具有较好的 线性关系（ＨＰＲＴ：ｒ ＝０．９９７、Ｙ：一０．２９ｘ＋１２．１２， Ｆｏｘｐ３：ｒ ＝１．００，Ｙ＝一０．２９ｘ＋１１．４２）。本研究所 选的内参照基因为ＨＰＲＴ，经标化计算，培养后细胞 Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的表达明显高于未加雷帕霉素组，基 因表达水平是未加雷帕霉素组的５．０１３倍（见表 ２），经ｔ检验，Ｐ＜０．００１，差异有显著性。 ２．５单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验单 向混合淋巴细胞反应显示，Ｒ Ｔｒｅｇ细胞的增殖能力 仅为２９．１７％，明显低于ＣＤ４ Ｔ细胞组（１７２．９２％） 和Ｒ—Ｔｒｅｇ细胞（１００．１６％），经方差分析，各组间差 异有显著性，说明雷帕霉素扩增的ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔ细 胞对异原性抗原的刺激具有低增殖性（见表３）。 增殖抑制试验：当Ｒ Ｔｒｅｇ和Ｒ—Ｔｒｅｇ细胞与 ＣＤ４ Ｔ细胞比例为１：２时，Ｒ Ｔｒｅｇ细胞能显著抑 制ＣＤ４ Ｔ细胞的增殖，抑制率为７６．６％，而Ｒ—Ｔｒｅｇ 细胞对ＣＤ４ Ｔ细胞的抑制程度很弱，仅为２１．２％， Ｒ Ｔｒｅｇ对ＣＤ４ Ｔ细胞抑制率与Ｒ—Ｔｒｅｇ细胞对 ＣＤ４ Ｔ细胞抑制率相比，差异有显著性（Ｐ＜ ０．００５），表明雷帕霉素扩增的Ｔｒｅｇ对Ｔ细胞具有免 疫抑制性。 ２．６ ＩＬ一１０和ＴＧＦ—Ｂ的检测结果根据ＥＬＩＳＡ试 剂盒提供的标准品制作标准曲线，ＩＬ一１０的标准曲线 符合直线回归方程：Ｙ＝０＋ｂｘ，０＝０．０２２ ６３６，ｂ＝ ０．００１ ８８１，ｒ２＝０．９９９ １３１，残差平方和＝０．０１０ ３５２。 ＴＧＦ－１３１的标准曲线符合二次曲线回归方程：Ｙ＝ｎ＋ ｂ＋ ，０＝０．０５１ ３１５，ｂ＝０．０００ ３７１，ｃ＝０．０００ ００２， 残差平方和＝０．０２４ ６０３。Ｒ Ｔｒｅｇ培养上清中ＩＬ． １０、ＴＧＦ一１３１含量明显高于Ｒ—Ｔｒｅｇ培养上清中的含 量，结果见表４。 ３讨论 调节性Ｔ细胞根据来源、细胞特性和作用机制 大致分为两类，一类是来源于胸腺的固有ＣＩＭ ＣＤ２５ 调节性Ｔ细胞；另一类是外周诱导产生的具 有抑制免疫应答功能的ＣＤ４ Ｔ细胞和ＣＤ８ Ｔ细 胞，包括外周经诱导生成的ＣＤ４ ＣＤ２５ 调节性Ｔ 细胞、Ｔｒｌ、Ｔｈ３及ＣＤ８ 抑制性Ｔ细胞等。叉头状转 录因子Ｆｏｘｐ３是固有ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ特异的标志 物之一。 ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞具有免疫无能性和免疫抑 制性两大功能特征。其免疫无能性表现在对高浓度 ＩＬ．２的单独刺激，固相包被或可溶性抗ＣＤ３单抗， 以及抗ＣＤ３单抗、抗ＣＤ２８单抗的联合作用呈无应 答状态，也不分泌ＩＬ－２。ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞的免疫 抑制性表现在经ＴＣＲ介导的信号刺激活化以后能 够抑制ＣＤ４ 和ＣＤ８ Ｔ细胞的活化和增殖，在器官 移植和自身免疫性疾病中能发挥免疫调节作 用 。由于固有ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ在体内含量极 少，而ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ的体外扩增仍然面临着扩 增效率不高，或者扩增的细胞为活化的ＣＤ４ Ｔ细 胞，因而不具有免疫抑制作用或者抑制作用较弱。 有作者采用ＣＤ３７ＣＤ２８单抗包被的Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ作为 人工抗原递呈细胞，以及高浓度的ＩＬ－２进行人 ＣＤ４ ＣＤ２５ 调节性Ｔ细胞体外扩增¨ 。 本文研究证实，雷帕霉素能够选择性扩增 ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ，可以避免非特异性的体外扩增。 采用雷帕霉素终浓度为１０ ｎｍｏｌ／Ｌ、ｏｔＣＤ３、ｃｔＣＤ２８和 中国免疫学杂志２０１２年第２８卷 小剂量的ＩＬ－２的培养体系，结果显示，无论从表型 的检测、特异性Ｆｏｘｐ３ ｍＲＮＡ的定量分析，还是体外 的抑制实验以及培养上清中细胞因子的检测，雷帕 霉素扩增出ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞均明显地高于未加 雷帕霉素扩增的ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞，而且体外的抑 制能力也明显增强，说明雷帕霉素扩增出的ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞具有免疫抑制性和低反应性，而未加 雷帕霉素扩增出的ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ细胞具有较低的 免疫抑制性和较强的增殖反应性，多为效应性Ｔ细 胞，与Ｓｔｒａｕｓｓ等¨ ” 结果基本一致。 雷帕霉素与ＦＫ５０６结合蛋白（ＦＫＢＰ１２）结合后 形成ＦＫＢＰ１２一雷帕霉素复合物，进而抑制雷帕霉素 的靶基因（ＴＯＲ），而ＩＬ．２受体的信号传导依赖 ＴＯＲ，可以抑制效应型Ｔ细胞的增殖，用于自身免疫 性疾病和移植物抗宿主病的预防和治疗。由于 ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ增殖的信号通路不同于ＣＤ４ ＣＤ２５ 效应型Ｔ细胞，可能通过ＪＡＫ／ＳＴＡＴ５途 径 ，因此雷帕霉素不抑制ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ的增 殖，在雷帕霉素存在的条件下，ＣＤ４ Ｔ细胞受到抗 原和第二信号的刺激，ＣＤ４ ＣＤ２５ 效应型Ｔ细胞的 增殖受抑制，导致选择性ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ的增殖。 雷帕霉素在体外能选择性扩增ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞，与天然ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒｅｇ细胞的功 能相似，具有低增殖性和低反应性，为临床开展细胞 治疗提供可行体外扩增的方法。 ４参考文献 １ Ｓａｋａｇｕｅｈｉ Ｓ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ａｓａｎｏ Ｍ ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｔｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎｓ （ＣＤ２５）．Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｌｆ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃａｕｓｅ ｖ￣ｒｉｏｕｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５；１５５（３）：１１５１— １１６４． ２ Ｂａｅｃｈｅｒ—Ａｌｌｅｎ Ｃ．Ｂｒｏｗｎ ＪＡ．ＦｒｅｅｍａｎＧ Ｊ ｅｔ ａ１．ＣＤ４ ＣＤ２５ ｒｅｇｕｌａ— ｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００１；１６７：１２４５－ ｌ２５３． ３ Ｓｈｅｖａｃｈ Ｅ Ｍ．ＣＤ４ ＣＤ２５ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ｍｏｒｅ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｔｈａｎ ａｎ－ ｓｗｅｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２；２（６）：３８９４００． ４ Ｉｔｏ Ｔ，Ｈａｎａｂｕｃｈｉ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｙ Ｈ ｅｔ ａ１．Ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ＦＯＸＰ３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２００８；２８（６）：８７０－８８Ｏ． ５牛燕燕，马梁明，周英ｅｔ ａ１．ＣＤ４ ＣＤ２５ 调节性Ｔ细胞和细胞 因子与异基因造血干细胞移植后ａＧＶＨＤ的相关性研究［Ｊ］．中 国实验血液学杂志，２０１０；１８（３）：７３５－７３９． ６杨明珍，吴德沛，陈广华ｅｔ ａ１．ＣＤ４ ＣＤ２５ ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞 与小鼠异基因造血干细胞移植ＧＶＨＤ相关性研究［Ｊ］．中国血液 流变学杂志，２００７；１７（３）：３５６－３５９． ７孙道萍，吴德沛，李彩霞ｅｔ ａ１．ＣＩＭ ＣＤ２５ 调节性Ｔ细胞在异 基因造血干细胞移植后的重建及其与ａＧＶＨＤ的相关性［Ｊ］．中 杨明珍等小鼠ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ 调节性Ｔ细胞体外扩增第２期 １１３・ 国免疫学杂志，２００７；２３（８）：５４－５８． ８杨明珍，吴德沛，岑建农ｅｔ ａ１．雷帕霉素诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠ＣＩＭ ｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｕｌ－ ｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｐａｍｙｃｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７；１７８（１）：３２０－３２９． １４ Ｂａｔｔａｇｌｉａ Ｍ，Ｓｔａｂｉｌｉｎｉ Ａ，Ｍｉｇｌｉａｖａｃｃａ Ｂ ｅｔ ａ１．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４ ＣＤ２５ ＦＯＸＰ３ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ＣＤ２５ ｆｏｘｐ“调节性Ｔ细胞增殖［Ｊ］．中国药理学通报，２００７；２３ （６）：７９５￣９９． ９ Ｎｅｇｒｉｎ Ｒ Ｓ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｒａｆｔ ｖｓ ｂｏｔｈ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００６；１５；１７７（１２）：８３３８－８３４７． １５ Ｃｏｅｎｅｎ Ｊ Ｊ，Ｋｏｅｎｅｎ Ｈ Ｊ，ｖａｎ Ｒｉｊｓｓｅｎ Ｅ ｅｔ ａ１．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ａｎｄ ｎｏｔ ｃｙ－ ｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ，ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ２７ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕ— ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０１１；２４（３）：４５３— ４５７． １０ Ｄｕｍｍｅｒ Ｃ Ｄ，Ｃａｒｐｉｏ Ｖ Ｎ，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｌ Ｆ ｅｔ ａ１．ＦＯＸＰ３（＋）ｒｅｇｕｌａ— ｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｊｅｅｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎａｌ ａｌ— ｍａｎ ＣＤ４ ＣＤ２５ ｒｅｕｌｇａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００６；１０７（３）： １０１８—１０２３． ｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２；２６（１）：１－１０． １ｌ Ｋａｗａｓｈｉｒｉ Ｓ Ｙ．Ｋａｗａｋａｍｉ Ａ．Ｏｋａｄａ Ａ ｅｔⅡ ．ＣＤ４ ＣＤ２５ ｇｈ ＣＤ１２７ 。 ‘Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ￣ｅｑｕｅｎｃｙ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ １６ ＢｅｎｓｉｎｇｅｒＳ Ｊ，Ｗａｌｓｈ ＰＴ，Ｚｈａｎｇ Ｊ ｅｔ ａ１．ＤｉｓｔｉｎｃｔＩＬ－２ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｕａ－ｇ ｌｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ＣＩＭ ＣＤ２５ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００４；１７２：５２８７－５２９６． ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｒｈｅｕｍａ－ ｔｏｌ，２０１１，２０１１；３８（１２）：２５１７－２５２１． １２蓝三春，石蕊，张晓颖ｅｔ ａ１．人ＣＤ４ ＣＤ２５ 调节性Ｔ细胞体 ［收稿２０１１－０９－２７修回２０１１－１１－０７］ （编辑张晓舟） 外扩增［Ｊ］．中国免疫学杂志，２０１０；２６（１０）：９１３－９１８． １３ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｌ，Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ Ｔ Ｌ，Ｋｎｉｇｈｔｓ Ａ ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｎａｔｕ－ （上接第１０８页） １１ Ｈｏａｏｎ Ｐ，Ｐａｒｋ Ｋ Ｊ，Ｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａ１．ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａ— １ ７４１—１７４８． ｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ［Ｊ］，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００７；３５：Ｗ５８５－Ｗ５８７． １２ Ａｍａｌｄ Ｋ．Ｂｏｒｄｏｌｉ Ｌ．Ｋｏｐｐ Ｊ ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ ｗｏｒｋｓｐａｅｅ：ａ Ｈｏｍｅｒ Ｄ Ｓ，Ｐａｖｅｓｉ Ｇ，Ｃａｓｔｉｇｎａｎｏ ｒＴ ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｓｔ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｘｔ－・ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅ－・ ｗｅｂ．ｂａｓｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅｓ，２００６；２２（２）：１９５－２０１． １３ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ—Ｍａｎｚａｎｅｔ Ｒ，ＤｅＫｒｕｙｆｆ Ｒ，Ｋｕｃｈｒｏｏ Ｖ Ｋ ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｏｓｔｉｍｕ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ，２０１０；１１（２）：１８１—１９７． １７ Ｆｅｎｇ Ｂ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｈｅ Ｓ Ｈ ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ—ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＴＩＭ）－１／ＴＩＭ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｈｅｒａ— ｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＩＭ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．１ｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００９；２２９（１）：２５９－ ２７０． ｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｍｏｄｅｌ［Ｊ］． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８；１２２（１）：５５－６１． １４ Ｍｏｏｒｅ Ｊ Ｈ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７；２１３（２）：３６５－ ３６９． ［收稿２０１１－０４—２７修回２０１１－１０—１３］ （编辑倪鹏） １５ Ｆｅｍａｌｄ Ｇ Ｈ，Ｃａｐｒｉｏｔｔｉ Ｅ，Ｄａｎｅｓｈｊｏｕ Ｒ ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅｓ ｃｈａｌｌｅｎ－ ｇｅｓ ｆｏｒ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１ １；２７（１３）： 启事・ 本刊诚聘特约审稿人 《中国免疫学杂志》是中国免疫学会会刊，主要报道我国免疫学研究的各项国家科研课题，是全面反映 中国免疫学整体水平的主流媒体。为了进一步加快审稿速度，缩短稿件刊用周期，特诚聘特约审稿人数名， 组建审稿专家队伍，详情请登陆本刊网站，Ｗｅｂ ｓｉｔｅ：ｗ１Ａｒｗ．ｉｍｍｕｎｅ９９．ｃｏｒｎ；ｗｗｗ．中国免疫学．中国。 《中国免疫学杂志》编辑部
