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生物技术的两次革命

生命科学技术是当前发展速度最快、与人类时间关系最密切的学科领域之一。在二十世纪生物科学经历了两次革命。第 一次革命发生在1953年，美国生物学家沃森（J.D.Watson，1928— ）和英国生物物理学家克里克（C.Crick，1916— 2004）提出了DNA双螺旋结构模型。这一模型在生物学发展史上是一个伟大的里程碑，他极大改变了生物学的面貌，促进 生物学研究进入分子水平，并为分子生物学的进一步发展奠定了基础。第二次革命发生在70年代初，产生了以DNA重组技 术为前沿和核心的现代生物技术，对基因进行分子施工和操作成为可能，于是出现了基因工程和其他种种生物工程。生 物技术革命带来的两个重点的结果：一个生物学以空前的速度突飞猛进地发展：二是现代生物科学技术的指导下生物技 术产业群迅速兴起。

最早的生物学即对生命物体的系统认识是在中世纪从医学和农学中分化出来的。19世纪生物学获得迅速发展，生物学的 几个重要分支学科包括细胞学、胚胎学、微生物学、生理学和生物化学都在这一时期建立并日趋成熟。影响尤为深远的 是达尔文（C.R.Darwin，1809—1882）的进化论和孟德尔（G.Mendel，1822—1884）的遗传理论。 【数理科学对生物学的渗透与分子生物学的雏形】

数理科学对生物学的渗透带来了新的研究方法和技术，带来了新的思想和构思。从19世纪光学显微镜问世到20世纪出现 电子显微镜，显微技术的进步促进了生物学向微观方向发展，生物学出现了三个研究学派：结构学派、信息学派和生化 遗传学派。

其中结构学派用X射线晶体学技术研究生物大分子结构。“分子生物学”这一术语即是由结构学派的代表阿斯特伯里（ W.T.Astbury，1898—1961）所创立。阿斯特伯里在他个人后期研究中对DNA的X射线衍射研究作了某些奠基工作。稍后， 威尔金斯（M.Wilkins,1916— ）和富兰克林（R.franklin，1920—1958）在伦敦的王室学院进行DNA的结构研究，获得 了清晰的X射线衍射图，为沃森和克里克构建DNA双螺旋结构模型提供了依据。

信息学派致力于研究遗传信息的编码与传递。信息学派对生命本质的研究是在受量子理论影响的思潮中开始的。最初的 影响来自原子结构的建立者、量子理论的奠基人之一波尔（N。Bohr，1885—1962）.1932年波尔在题为“生命和光”的 演讲中指出对生命现象的研究可能导致发现物理学和化学的新定律。波尔的学生德尔布吕克（M.Delbruck，1906—1981 ）继承和发展了波尔对生物学的学术见解，成为物理学家转向生物学研究取得巨大成功的典范。上个世纪30年代中期德 尔布吕克从欧洲转到美国加州理工学院，并与摩尔根（T.H.Morgan，1866—1945）以及一批研究果蝇的遗传学家交往密 切。30年代末，德尔布吕克遇到了从法西斯统治下的意大利逃亡出来的卢里亚（S.Luria，1906—1981）和赫尔希（ A.D.Hershey，1908— ），他们一起组成了著名的“噬菌体小组”，开始信息学派富有启发性的研究工作。沃森是噬菌 体小组最年轻的成员，沃森和克里克一起提出了DNA双螺旋结构模型，从而促进了统一的分子生物学的建立和发展。 生化遗传学派致力于基因生物化学的研究。20世纪初孟德尔关于遗传的理论研究成果被重新确认。1909年丹麦植物学家 约翰森（W.L。johannsen，1857—1927）提出来基因这一名词，用来指控制生物性状的遗传因子，并提出基因型和表现 性这两个术语。稍后，摩尔根在研究果蝇的突变时发现某些性状与性别相关联，称为性连锁，而摩尔根进一步的研究发 现在染色体基因之间还可以发生交换。孟德尔发现的分离定律、自由组合定律，加上摩尔根发现的连锁和交换，合称遗 传的三大基本定律。1926年摩尔根发表了《基因论》，摩尔根和其他一些学者认为基因可以通过某种方式影响代谢。在 摩尔根领导的研究小组里，缪勒（H.Muller，1890—1967）是小组中最年轻、最富有想象力的一员。缪勒是第一个用果 蝇来系统研究突变的遗传学家。1927年，缪勒发现了X射线能强烈引起基因突变。20世纪30年代后期，遗传学家比德尔（ G.WBerdle，1903—1989）和微生物学家塔特姆（E.L.Tatum,1909—1975）合作开创了生化遗传学研究的辉煌时代，1945 年比德尔和塔特姆得出结论，基因突变引起酶的改变，每一个基因控制产生一种特殊的酶，这就是“一个基因一种酶” 学说。

【DNA双螺旋结构模型与第一次生物学革命】

1868年米歇尔（J.F.Miescher，1844—1895）开创了细胞核化学的研究。米歇尔从细胞中分离出来了一类当时未知的细 胞成分，称之为核素。奥尔特曼（R.Altmann）继续了米歇尔的研究，并于1889年提出“核酸”这一名词。稍后，科泽尔 （A.Kossel，1853—1927）和费歇尔（E.Fischer，1852—1919）完成了对核苷酸中碱基的分离和鉴定工作。而核酸中糖 的分析鉴定以及核苷酸键的确定则是由莱文（P.A.Levene，1869—1940）完成的，莱文提出了“四核苷酸假说”。 对核酸研究得到重大发展首先是从方法技术上取得突破开始的。20世纪40年代，卡斯帕逊（T.Caspersson）建立了可用 于定量测定细胞核酸的为紫外分光光度技术，布雷切特（J.Brachet）发展了组织化学技术，唐斯（A.L.dounce）采用的 亚细胞结构分离技术，以及达维生（J.N.Davidson）的生化分析技术，有力证明了DNA和RNA是所有生物细胞共同的重要 组成物质，DNA存在于细胞核，RNA存在于细胞质。

查伽夫（E.chargaff，1905— ）通过精确的定量分析，证明不同来源核酸的碱基并非以等摩尔比存在，这就推翻了莱文 的“四核苷酸假说”。查伽夫发现含氨碱基（腺嘌呤和胞嘧啶）和含酮碱基（鸟嘌呤和胸腺嘧啶）的总量相等，总量比 之是一个决定于生物来源的特征值。这一规律被称为查伽夫法则，他是DNA结构规律的反映，成为后来沃森和克里克构建 DNA结构模型的依据。

1944年艾佛里（O.T.Avery，1877—1955）首次用实验证明细菌遗传性状的转化因子是DNA。但及至1952年赫尔希和蔡斯 （M.Chase,1927— ）用噬菌体证明遗传物质是DNA，才被学术界较为普遍的接受。遗传物质是DNA，那么DNA是如何携带 遗传信息并通过复制有亲代传递给子代的？沃森和克里克于1953年提出的DNA双螺旋结构模型回答了这一问题。克里克总 结了当时分子生物学的基本认识，于1958年提出了中心法则。1970年梯明（H.Temin，1934—1994）和水谷哲（

S.Mizutani）提出了“原病毒假说”，同年，巴尔的摩（D.Baltimore，1938— ）发现了逆转录酶，证明了原病毒假 说。梯明和巴尔的摩的工作纠正和补充了克里克早期提出的中心法则的不足。

【生物技术兴起导致第二次生物学革命】

20世纪70年代初以重组DNA技术的诞生带动了现代生物技术的兴起，并导致生物学的第二次革命。重组DNA技术是指对DNA 分子的重新设计、切割和连接，也即是基因操作。20世纪70年代初发现特异切割DNA的限制酶，绘制出DNA被限制酶切割 的限制图谱，使DNA分子克隆可能。克隆指无性繁殖系，分子克隆也就是分子的大量扩增系统。DNA插入自主复制载体， 导入细胞，即可获得大量扩增。DNA快速测序法是重组DNA的关键技术，它的产生才能对DNA分子进行设计和操作。重组 DNA最核心的技术包括DNA的测序、特异切割和连接、分子克隆以及基因表达。

在20世纪50年代，阿尔伯（W.Arber，1929— ）研究证明大肠杆菌能使自身DNA带上特异标志并降解外来的DNA。史密斯 （H.O.Smith，1931— ）小组首次分离到特异切割DNA的限制酶。次年内森斯（D.Nathans，1928— ）将限制酶HindⅡ用

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于切割猴病毒SV 40，获得病毒DNA的限制酶切图谱。史密斯和内森斯一起制定了限制酶的命名规则。20世纪60年代初， 霍利（R.W.Hollery，1922—1993）测定了酵母丙氨酸tRNA核苷酸序列。20世纪70年代初，桑格（F.Sanger，1981— ） 提出了双脱氧核苷酸法测定核苷酸序列，这一方法被用于自动化仪器测定核苷酸序列。1972年伯格（P.Berg,1926—）发 表将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入SV 40的生化方法。1976年，吉尔伯特（W.Gilbert，1932— ）创造了DNA 的化学测序法。

随着基因克隆和表达技术的日趋成熟，这一技术带给人们希望的同时也引起了忧虑。1975年美国加州西洛马国际会议上 与会科学家一致肯定了基因操作的积极意义和安全问题，号召开发安全的细菌和质粒。1977年板仓敬一（K.Itakura）和 博耶利用重组DNA技术合成了第一个基因工程产品，即用于治疗四肢巨大症的生长激素释放抑制激素（somatostatin， SMT）。于是新的基因技术公司如雨后春笋般纷纷成立，生物技术产业由此开始崛起。

生物科学技术将是21世纪的领头学科

生命运动是包括了数学、物理、化学、信息等的运动，现在生命学科已日益趋向成熟并成为发展最快的学科，对生命科 学的研究可以带动其他科学。生物科学技术与人类生产和生活关系密切，生物技术产业已成为现代领头产业之一，信息 经济时代将转化为生物经济时代。生物科学技术是各学科共同关注的焦点，也是学到学科的科学家共同参与研究的领 域，他汇聚了有关学科各种新的思想、新的方法、新的技术，成为最活跃、最富有挑战性和启发性的交叉学科。 各种生物工程之间有所不同，但它们的技术系统往往互补。在完成一项生物工程的过程中，基因操作属于上游技术，分 离纯化工艺属于下游技术。基因工程、酶和蛋白质工程、免疫工程、发酵工程和生化工程基本是在分子水平上进行操 作，细胞工程、胚胎工程和组织工程则是在细胞和细胞以上层次的工程操作。生物芯片、生物信息技术和生物模拟技术 是对生物结构和功能的信息分析和模拟。

【基因工程技术】

一、基因的分离和合成

利用限制酶切割生物基因组DNA，然后用合适方法可以分离到所需要的基因。此法仅限于基因组非常小才可行。倘若基因 的序列是可知的，可用化学方法来合成，或者用聚合酶链式反应有模板DNA扩增得到。从染色体中分离基因最常用的方法 则是建立一个基因文库，或者cDNA文库，从中筛选出目的基因克隆。

1.构建基因文库

基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体活动的分子克隆之总和。构建基因文库首先要将染色体DNA切割成为随 机片段。用限制酶部分消化DNA得到带有特异黏性末端的片段，较容易插入载体。而克隆载体则必须携带复制起点和选择 标志。最常见的是对抗生素的抗性基因。为了能克隆较大片段的DNA，常选择λ噬菌体载体或柯斯质粒作为克隆载体。将 染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接。然后重组体DNA与λ噬菌体包装蛋白在体外包装。所组成的是具体颗 粒能将被包装的DNA送入宿主细胞内。重组体DNA送入宿主细胞后以染色体外基因方式复制，但不发生整合，可在细胞呢 重新组成噬菌体颗粒并裂解宿主细胞。所产生的溶菌产物包含全部重组噬菌体克隆，即为基因文库。构建得到的基因文 库应测定其库容量，即库中包含的克隆数，并抽查克隆的重组DNA是否正确。一个基因文库可以多次使用，从中筛选出各 种克隆基因。 2.构建DNA文库

真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物的基因是间断的，基因表达的编码序列被非编 码序列分隔开。需经转录后，在RNA加工过程中非编码的内含子才被切去。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达， 只有将成熟mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），并接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。而且，真核 生物基因组中通常只有一小部分基因表达。由于mRNA极不稳定，常将其逆转录成cDNA后再进行分析。为分离cDNA克隆或 者研究细胞的cDNA谱，需要先构建cDNA文库。所谓cDNA文库是指在细胞全部mDNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

mRNA极易被核糖核酸酶所降解，故在提取过程中，常先将用强蛋白变质剂破坏核酸酶，所有器皿物件都要防止被核酸酶 污染，并在反应体系中加入核糖核酸酶的抑制剂。真核生物mRNA的3'段带有多聚腺苷酸（ploy A），它与多聚胸苷酸（ ploy dT），将固相化的多聚胸苷酸用于扑捉mRNA，通过这种亲和层析法得到纯的mRNA。用寡聚胸苷酸（oligo dT）作为 逆转录的引物，以mRNA为模板合成双链cDNA。然后与构建基因文库相似，将cDNA文库插入克隆载体，所得到的全部cDNA 克隆即为cDNA文库。总的说来，构建cDNA文库包括以下步骤：制备mRNA,合成双链cDNA，制备载体DNA，cDNA的分子克 隆，对cDNA文库作鉴定，必要时加以扩增。从cDNA文库中可以筛选到编码蛋白质的cDNA，也可用以分析基因的表达谱。 3.DNA的化学合成

20世纪50年代卡拉那（khorana）开创了DNA化学合成的磷酸二酯法，他将核苷酸所有能参与化学反应的活性基团都用保 护剂加以封闭，只留下需要连接的基团；用缩合剂使一个核苷酸的羟基与另一个核苷酸的磷酸基之间形成一个磷酸二酯 键，从而发生定向聚合。1960年，莱特辛格（letsinger）发明了磷酸三酯法，即将三个磷酸基中的一个保护起来，剩下 的两个酸根可以形成磷酸二酯，这样既减少副反应，简化了分离纯化步骤，而且还提高了产率。稍后，莱特辛格又发明 了亚磷酸三酯法，使得反应速度大大提高，并实现了核酸化学合成的固相化和自动化。20世纪80年代已有性能优良的DNA 合成仪问世，一次可以合成100多个核苷酸，每合成一个核苷酸只需7—10分钟。

二、基因定位诱变

基因定位诱变是基因工程的一项关键技术，基因定位诱变是按照设计的要求使分离到的基因能够进行任意加工，包括对 基因的特定序列发生插入、删除、置换、和重排等变异，以提高表达水平和改进基因性能的技术。目前常用的定位诱变 方法之一是在酶切位点处插入和删除一定序列，其中用一段人工合成的DNA片段来取代基因中两酶切位点间的序列即盒式 诱变。应用一组随机序列片段作盒式诱变可以得到一群突变体，从中选择出最适宜的突变体，即实验进化。而用合成的 寡核苷酸在体外诱导单链噬菌体发生变异即寡核苷酸指导的定位诱变。1983年史密斯（M.Smith，1932— ）用单链噬菌 体M13载体克隆基因，得到单链重组体DNA ，然后用新设计诱变的寡核苷酸作为引物（其中引入错配碱基），在体外用酶 复制得到双链DNA，在用双链DNA转化宿主细胞，后代有一半为野生型，另一半来自诱变的DNA，即为突变型。此外，PCR 诱变通过PCR引物在扩增DNA片段的两段引入各种变异，包括插入、删除和置换核苷酸。

三、聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应即借助DNA聚合酶在体外连续进行基因扩增。1983年，马利斯（K.Mullis，1944— ）发明了PCR快速扩增 DNA，但马利斯采用大肠杆菌DNA聚合酶的大片段来复制基因，每次加热变性DNA都使酶失活，需要重新添加酶，操作十分 不方便。其后赛基（Saiki）从栖热水生菌中提取出耐热的DNA聚合酶即Taq DNA聚合酶使PCR技术趋于成熟。PCR技术只要 知道DNA片段两端序列，设计出一对引物，并设定退火、延伸和变性三个步骤的温度和时间，就可以反复扩增。经过25— 30个循环，扩增倍数达到十的六次方以上，哪怕只有几个分子的样品，一根毛发，一滴血迹或汗渍都能检测出来。 四、克隆基因的表达

1.真核生物在原核生物中的表达

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为了大量获得真核深谷我细胞内的微量蛋白质，可以通过基因工程将其编码序列cDNA接上原核生物表达的调控元件，导 入原核生物细胞，用大规模发酵方法生产。 2.外源基因在植物细胞中表达

根瘤土壤杆菌是诱发裸子植物和双子叶植物产生冠瘿的病原菌。根瘤土壤杆菌的质粒称为Ti质粒（tumor inducing

plasmid），即诱发主宿植株产生肿瘤的质粒。其大小在200千碱基对（kbp）左右，为双链闭环分子。Ti质粒中与诱发肿 瘤有关的区段有两个，即T区段和毒性（vir）区段。T区段DNA称为TDNA。TDNA携带的基因只有插入植物染色体后才能被 激活，其中包括合成冠瘿碱的基因（如nos），细胞分裂素合成酶的基因（tmr）和植物生长素合成酶的基因（tms1&tms2 ）。tmr、tms1&tms2统称肿瘤基因（onc）。Ti质粒是理想的植物基因工程载体，将外源基因插入TDNA内，即可借以转化 植物细胞。1982年利用Ti质粒改造成基因载体获得成功，转基因植物的研究得到迅速发展。 3.克隆基因在动物细胞中的表达

应用基因工程技术培育转基因动物，常将外源DNA显微注射到受精卵的核内，从而是成体的生殖细胞和体细胞均带有外源 基因。最早培育成功的转基因动物是小鼠，外源基因采用大鼠的生长激素基因，从而得到了表达高水平的生长激素的硕 鼠，硕鼠的生长速度比正常小鼠几乎快了一倍。

五、人类疾病的基因治疗

转基因动物获得极大成功，于是继而考虑基因转入人体细胞中，用于治疗各种恶性疾病，正在研究采用基因治疗（gene therapy）的疾病包括遗传病、肿瘤、老年痴呆症、糖尿病和艾滋病。人类基因操作进入临床试验开始于1989年5月，美 国国立卫生研究院（NIH）的罗森伯格（S.A.Rosenberg）首次将外源标记基因导入人体。1990年9月，美国国立卫生研究 院（NIH）的布莱斯（M.K.Blaese）首次进行人类基因治疗的临床试验，从而揭开了人类医疗历史的新篇章。目前国内外 进行基因治疗的病人已经有数千例，用于治疗疾病的基因大致有四类：一类是用正常基因去弥补有缺陷的基因，以治疗 遗传性疾病。二是通过转移抗体基因或细胞因子基因来提高免疫力，以抵抗或者杀死病变细胞。三是所转移基因用以配 合细胞或药物治疗，或者增强治疗特异性，或者增强疗效。四是导入能产生某些核酸治疗剂的基因。目前基因治疗的技 术尚不成熟，其关键在于如何选择有效的治疗基因，如何构建安全载体，病毒载体效率较高，但有潜在的危险性。如何 定向导入靶细胞，并获得高表达。

【酶和蛋白质工程技术】 一、蛋白质工程

1983年在美国基因公司的厄尔默（Ulmer）首先提出蛋白质工程这个名词，它是指在X射线晶体学揭示蛋白质结构的基础 上，根据结构与功能的关系，借助计算机辅助设计（computer aided design），并通过基因定位诱变，以改变蛋白质的 结构，达到改进蛋白质性能的目的。蛋白质的分子改造通常需要先经过周密的分子设计，然后用基因工程获得突变型蛋 白质（mutein）并检验是否达到预期的性能。

蛋白质工程依赖于三个技术系统：X射线晶体学技术、计算机分子设计和基因定位诱变。蛋白质工程能使一些具有重要生 理作用，可作为药物的细胞因子的稳定性增加，以利于生产和提高疗效。此外，蛋白质工程还可以将不同生物蛋白质的 优点集中在一起，即优化组合而获得改进性能的蛋白质。

二、蛋白质的实验进化

通过大量随机变异和定向靶功能的选择，以获得改进性能的蛋白质的过程，即实验进化。蛋白质的实验进化包括变异、 选择和扩增三个过程的循环重复。可遗传的变异是进化的基础，从随机突变体库中选择合适的突变体然后通过扩增将选 择到的突变体保存下来。

变异包括突变和重组。将易错PCR产物进行DNA改组（DNA shuffling），可以增加异质性，促使有害变异与有益变异分 离，通过选择获得有利变异的优化组合。DNA改组包括三个步骤：首先将DNA片段化，然后通过片段间的重叠进行自身引 起的PCR，最后利用两端引物进行PCR是片段重组合。

自然选择通过对生物表现的性状（表型）来选择其基因型，在分子水平上通过基因产物（蛋白质）来选择基因。噬菌体 展示技术将外源蛋白与噬菌体外科蛋白融合，使外源蛋白能以相对独立的结构与功能展示在噬菌体表面，而外源蛋白的 基因则位于噬菌体或噬菌粒内。噬菌体展示技术将展示的蛋白质与其基因偶联在一起，因此在选择到突变型蛋白质的同 时也就选择到了他的基因。

三、酶工程

酶分子的改造是蛋白质工程的重要内容。用蛋白质工程的方法提高酶的活性和特异性，提高酶对酸、碱和热的稳定性， 改变反应介质和动力学的性质，从而可以改进现有的工业用酶，并开发更多的工业用酶。

自然界存在的酶的稳定性差，活性受到反应条件限制，因而影响了他们的开发利用。通过对酶分子的化学修饰，包括对 主链的切割和连接、化学基团的引入和分子侧链的交联，有可能改变酶的性能。

在生产中有时将细胞作为多酶系统来对待，将细胞固定在适当载体上，可以省去提取酶的工艺，由细胞内酶系统连续催 化反应，即固定化细胞（或称固相化细胞）。固定化细胞分为固定化死细胞、固定化休眠细胞和固定化繁殖细胞。 固定化细胞也包括酶的固定化。酶的固定化，增加了酶的稳定性，使得在反应完成后易于回收酶，在合成某些化工产品 的非水溶剂内也能催化反应的进行，酶的固定化，不但能够适应自动化连续生产，而且缩短了纯化工艺流程，降低了成 本。

【免疫工程技术】

19世纪末德国科学家贝林（E.V.Behring，1854—1917）发现白喉抗毒素，并首创白喉的血清疗法。贝林用白喉外毒素免 疫动物（用抗原注射到动物体内以产生免疫反应）从而获得含特异抗体的血清（抗血清）即第一代抗体。至今临床诊断 和治疗用的抗体或抗血清主要还是这类抗体。

20世纪中叶，伯内特（F.M.Burnet，1899—1985）提出抗体克隆选择理论。当抗原免疫动物产生抗体时，通常能够产生 多种识别同一抗原的不同抗体。它们或者是识别抗原分子的不同表面部位（表位），或者是识别同一表位的不同结构的 抗体。1975年科勒（G.j.F.Kohler，1946—1995）和米尔斯坦（C.Milstein，1927— ）将小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细 胞免疫小鼠后的脾淋巴细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，它既能像淋巴细胞那样产生抗绵羊红细胞抗体，又能保持骨髓 瘤细胞无限分裂的能力，由此创立了杂交瘤技术。杂交瘤包含许多淋巴细胞与肿瘤细胞的融合细胞，从中可以挑选出活 性相对最高、特异性相对最强的细胞株，其产生的抗体为单克隆抗体，也就是说由同一无性繁殖系所产生的抗体。通过

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淋巴细胞与肿瘤细胞融合产生的单克隆抗体即第二代抗体。

进入上个世纪八十年代，利根川进（S.Tonegawa，1939—）克隆出编码抗体免疫球蛋白（lg）基因可变区（V）和恒定区 （C）片段，证明B淋巴细胞在发育过程中抗体基因发生重排，在此基础上科学家们弄清楚了抗体基因的结构和重排机 制，使抗体采用基因工程生产成为可能。1985年史密斯（G.P.smith）将外源肽段基因与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合， 使外源肽段展示在噬菌体表面，创造了噬菌体展示技术。1990年麦卡弗蒂（J.Mecafferty）从淋巴细胞中扩增出抗体重 链可变区（Vh）和轻链可变区（Vl）基因片段，用柔性链连接，再与外壳蛋白基因融合，使单链抗体在丝状噬菌体表面 展示，构建了噬菌体抗体库。当用抗原作为选择剂，就可以从噬菌体抗体库中挑选出对抗原特异性结合的抗体。分离出 此特异抗体基因后，按照基因工程步骤就可大规模生产抗体。利用基因工程技术和表达抗体基因即第三代抗体。 【微生物发酵工程技术和生化工程技术】

微生物发酵工程是利用微生物的代谢和发酵作用进行现代化、大规模的生产，其主要工艺技术包括工程菌种的构建和选 育、菌体生长代谢和发酵过程的控制调节、微生物机能的利用等。发酵技术与美技术尤为密切，绝大多数工业用酶是由 微生物发酵生产的，另一方面许多传统上用发酵法生产的产品正在逐渐改用固定化酶或固定化细胞生产。发酵产品可以 是微生物菌体，如利用再生资源生产饲料蛋白、作为生物催化剂使用的微生物细胞；也可以是微生物的代谢产物，如氨 基酸、核苷酸和有机酸，及微生物的次生代谢产物，如抗生素、维生素、激素、生物碱、细胞毒素等。微生物发酵工业 具有巨大的社会经济效益，如利用微生物对工业废水和生活污水的净化处理，利用微生物对石油的二次开采和分解长链 烃以增加汽油产量。基因工程、酶工程、蛋白质工程、免疫工程和生化工程等，往往都要通过微生物发酵来进行大规模 的生产。

在对微生物发酵工程设备和工艺技术的研究和改进中，发展出了生化工程技术。生化工程技术包括生物反应器和传感器 的设计、生物反应的程序控制、产品分离精制技术等。生物反应器是生物技术工业的一个关键设备，它为活细胞或酶提 供使用的反应环境，以达到细胞增殖和产品形成的目的。现已有适合酶反应、微生物发酵以及大规模动植物细胞培养的 生物反应器和发酵罐。为了自动检测和控制生物反应器中有关参数，如搅拌速度、通气量、氧分压、PH值、氨含量等， 还需要配以各种传感器，尤其是能够灵敏的检测各种生物分子的浓度的生物传感器，如将酶固定在探头的薄膜上，利用 酶促反应产生氧化还原电势的变化测出溶液中底物和产物的浓度。

反应产物的分离纯化（分离纯化工艺）被称为生物工程的下游技术。酶反应和发酵反应完成后，需要进行适当的预处 理，如调节PH，出去菌体和某些不溶物，然后分离出粗产品，进一步在精制和纯化。分离纯化工艺需要安装产物性质来 设计，在实践中再不断改进，最常见的分离纯化方法包括盐析和有机溶剂分级沉淀、超滤技术、层析技术、电泳技术、 离心技术。

(1)盐析或有机溶剂分级沉淀：向反应产物溶液中加入大量易溶解的盐如氯化钠、硫酸铵，这些盐的离子能结合大量的 水，产物因此被盐沉淀出来。产物溶液中加入能和水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮，常常能降低产物溶解度，而使产物 沉淀。选择适当条件可使产物和杂质分开。

(2) 超滤技术：选择适当孔径的超滤膜或超滤中空纤维柱，通过抽滤加压使一定大小的分子能水一起穿过孔径，更大的 分子则被挡住，以此将产物分离出来。

(3)层析技术：使用滤纸、纤维素、树脂、凝胶颗粒、多空玻璃珠等填充支持物或者不同于溶剂的另一种液相作为固定的 介质对溶剂中的不同物质的结合力不一样，当溶剂向前推进时，溶剂中的不同溶质便可彼此分开。此外还有按分子大小 分开的分子筛层析，按解离能力和离子性质分开的离子交换层析，按生物分子间亲和力大小分开的亲和层析，以及按两 相溶液间分配系数差异而分开的逆流分溶。

(4)电泳技术：带有电荷的离子或颗粒在电场作用下向一个电击方向移动，离子或颗粒因其所带电荷和质量的不同，在电 场中的移动速度不同，因而彼此被分开。被广泛使用的是凝胶电泳，而毛细管电泳具有最灵敏的分析效果。

(5)细胞、细胞碎片和生物大分子在离心力场作用下能被沉淀下来。离心机在每分钟旋转10000次以下的低速是就能使细 胞沉淀，细胞碎片要在每分钟旋转20000到30000次的高速下才能被沉降，生物大分子则需要在每分钟旋转30000次以上的 超速离心方能克服分子热运动而被沉降。

【细胞工程技术】

细胞工程技术包括细胞融合（体细胞杂交）、单克隆抗体、核移植、动植物细胞的大规模培养、植物单倍体育种、体细 胞克隆动物和干细胞工程。 一、细胞融合技术

细胞融合是是两种选定的细胞通过化学融合剂、物理电击和生物因子如病毒等处理而发生合并，并能分别表现出原来两 细胞的某些性状。传统育种通常采取在个体水平进行杂交的方法，尤其是通过远源杂交使得优良性状得到更大的优化组 合，一些有益的隐形基因也能被选择出来，经过若干代谢选择才能选出优良的新品种。细胞融合在细胞水平进行杂交育 种，在较短的时间内选育出新品种，选育效果好，而且具有较强的针对性。细胞融合技术能产生一些特殊的杂交细胞， 如用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。在将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合过程中，常使用聚乙二醇（PEG）作为化学促融 剂，待细胞发生融合后即分开培养，获得单克隆细胞系。

二、细胞核移植和克隆动物

核移植是研究核质关系的重要途径。通过不同发育阶段和不同组织的细胞在核移植后的表现可以找出发育和分化过程中 核质的相互作用。

在动物发育过程中，基因组DNA和染色质发生了不可逆的修饰和重构，即动物发育具有不可逆性，因此，将分化的细胞核 移植到去核的受精卵或未受精的卵细胞内，可以使细胞重新开始发育。在此基础上产生了克隆动物，从而使动物“复 制”成为可能。

三、细胞培养技术

细胞大规模培养技术使得动植物内一些经济价值很高的微量成分能够用工业化的方式大量生产，也可以利用动植物细胞 进行特定的加工反应，或是获得大批均一的细胞。例如，利用生物反应器生产单克隆抗体、细胞因子、人参皂苷、桉树 油、紫三醇、生物碱等。如果基因工程的产品不是简单的多肽和蛋白质，就不能用细菌发酵来生产，酵母菌能对蛋白质 产物进行一定的糖基化，复杂的加工必须采用动植物细胞进行生产。

植物细胞培养步骤包括：外植株的选择与表面消毒；建立无菌培养系统；经培养外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组 织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根，长成小植株。外植株或愈伤组织细胞也可经液体悬浮培养，形成胚状体，再 诱导长成植株。

动物细胞培养包括贴壁培养和悬浮培养，血液细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞和一些转化细胞通常使用悬浮培 养。动物细胞培养的步骤包括：将组织剪切成小薄片；加入合宜浓度的胰蛋白酶或胶原纤维酶与EDTA进行消化使细胞分 散；将分散的细胞洗涤并纯化，以每毫升二百万至七百万个细胞的浓度加在培养基中，在37度进行原代培养，并实时传 代更换培养基。

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生物科技产业

四、细胞重建技术

自然界存在的生物细胞常常并不符合人类的生产要求，因此需要加以改造。借助细胞融合技术可以得到杂交细胞，从杂 交细胞中可以选择从符合人们需要的类型。培养细胞经人工诱变可以产生各种突变体细胞。紫外线诱变不需要昂贵仪器 设备，较易操作。化学诱变剂大多有致癌作用，需要小心操作。经诱变和筛选得到各种特殊的细胞，如营养缺陷型、抗 性、积累中间代谢物或次生代谢物及特异基因型的细胞。将外源基因导入细胞可以得到表达特殊性状的转化细胞。如导 入生产药物的基因、生产营养成分的基因或抗性基因，将细胞用于大规模生产或用于育种。外源基因导入细胞后，如果 以重组病毒或质粒形式存在，往往只能在一段时间内表达。

五、胚胎干细胞技术

在动物体内存中一些发育全能性的细胞，即未分化细胞，如鱼类、两栖类从受精卵分裂成两个细胞到囊胚期的细胞都具 有发育全能性，哺乳动物从卵裂两个细胞到64个细胞以及内细胞团的胚胎细胞也都具有发育全能性。胚胎干细胞即ESC（ embryonic stem cell）是正常的二倍体型细胞，能在体外人工培养，扩增和导入外源基因，并能以克隆形式保存。由胚 胎干细胞与8-10个细胞器的胚胎聚集在一起，或通过胚腔聚集在一起，或通过胚腔注射构成嵌合体。胚胎干细胞在嵌合 体内增殖并分化成各种组织，最后嵌合体发育成动物个体。此外，通过核移植或者细胞融合把胚胎干细胞的细胞核导入 去核的卵母细胞，然后转移到宿主输卵管种植在子宫内发育成个体。

【生物信息学】

上个世纪80年代，信息科学的概念、理论和方法被引入到生命科学中，促进了对生物体的定量研究。信息科学为研究生 物系统的信息提供了有效方法。已经有大量计算机程序可以用于分析生物基因组所包含的遗传信息，找出编码基因的阅 读框架和各种控制序列，解读生物的遗传语言。借助于特定的程序可以对生物基因组的遗传信息进行比较分析，找出他 们的遗传距离和各种的性状特征，并绘制出进化树。运用计算机不仅可以分析计算大量生物信息，从中找出生物学的规 律，还可以进行生物结构和功能的预测，从基因序列预测其可能的功能，从蛋白质的氨基酸序列预测其空间结构，从基 因点突变预测可能造成的形状改变。计算机还能进行各种生命活动过程的模拟，建立有关的模型。计算机为生命起源、 生物进化、人类大脑活动等研究提供了重要途径。

生物信息学是采用计算机技术和信息科学的方法，对生命科学中各种生物信息的采集、储存、传递、检索、分析和解读 的技术。生物信息技术一方面被用于生物学数据库包括DNA测序图谱、分子杂交、成像技术等获得的各类图形或者生化实 验所得到数据信息等，另一方面，通过软件对生物信息的处理和计算，预测生物大分子的空间结构，比较生物的蛋白质 序列、基因序列得出进化关系，从DNA序列中比较得出基因的模式识别等，推动基因组学、蛋白质组学、RNA组学的研 究、解决生物信息学的各类问题。

【生物芯片技术】 一、核酸芯片

1994年，皮斯（A.C.Pease）创立了光导寡核苷酸阵列化学合成法，为核酸芯片芯片技术奠定了基础。DNA芯片技术是在 SBN杂交测序技术的基础上，以基因组DNA、cDNA或者寡聚脱氧核苷酸作为靶点，按照微阵列固定在由硅片、玻片或者尼 龙膜构成的基片上，用于检测基因组序列，找出突变基因，确定基因多态性、或者用于测定基因表达谱，以及用于临床 诊断、法医和检疫鉴定的一项生物技术。 二、蛋白质芯片和组织芯片

将适体包括蛋白质样品、可识别特征结构的短肽或者可以折叠产生三维结构而与特定靶分子结合的单链DNA或RNA等按照 微阵列固定在基片上可以制作成蛋白质芯片。蛋白质芯片被用于化验、诊断、检疫、环保、刑侦等领域检测和鉴定各种 蛋白质以及研究蛋白质与各种生物分子相互识别和相互作用。

将组织样品按照微阵列固定在基片上即可制作成组织芯片。组织芯片用于DNA、mRNA的原位杂交，蛋白质的免疫组织化学 染色，疾病相关分子标志物的筛选，药物靶标的发现，以及与诊断、治疗、愈后有关参数的评估和应用等。 三、微缩芯片实验室

微缩芯片实验室是将分离纯化装置缩小在一块基片上，含有微型加热器、微型泵、微型阀门、微型流量控制器、微型生 化反应池、微型层析装置、毛细管电泳和微型光学检测器，通过厘米见方芯片上的缩微层析、电泳和各种生化制备装 置，完成对细胞内成分的提取、分离和分析过程，少数几个或者一个细胞的生物分子都可以得到分析分离。微缩芯片实 验室使得生化分析分离更加快速、高效、微量、低耗，并易于操作。

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