FMCA

・５３６・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＯｔｏｌｏｇｙＶｏ１．１３，Ｎｏ．３，２０１５　●　临床研究・　ＦＭＣＡ技术分析大前庭水管综合征家系及产前诊断　高慧　刘晶晶　沈姗姗　梁少明　危林耿　王沙燕　１暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院（深圳５１８０２０）　２亚能生物技术（深圳）有限公司（深圳５１８１３３）　【摘要】目的应用ＦＭＣＡ技术检测双侧前庭水管扩大家系ＳＬＣ２６Ａ４基因，探讨前庭水管扩大与ＳＬＣ２６Ａ４基因的关　系及ＦＭＣＡ技术最优条件。方法收集ＥＶＡ家系临床资料，基于荧光定量ＰＣＲ熔解曲线平台，运用ＦＭＣＡ技术分析　１０７例正常人，６个ＥＶＡ家系１９位成员的ＳＬＣ２６Ａ４基因ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ（９１９—２Ａ＞Ｇ），２１６８Ａ＞Ｇ及１２２９Ｃ＞Ｔ突变位点。并　用直接测序技术予以验证。结果１０７例正常人中有２例ＳＬＣ２６Ａ４基因杂合突变，突变率为１．８７％；ＥＶＡ家系中有３例　ＳＬＣ２６Ａ４基因纯合突变，３例ＳＬＣ２６Ａ４基因复合杂合突变，１０例ＳＬＣ２６Ａ４基因杂合突变，３例无ＳＬＣ２６Ａ４基因突变，　ＳＬＣ２６Ａ４基因突变率为８４．２１％。对家系ａ进行产前诊断，结果为ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ／１２２９Ｃ＞Ｔ复合杂合突变。所有检测结果　与测序结果一致，符合率为１００％。结论ＦＭＣＡ平台能快速检测ＳＬＣ２６Ａ４基因的ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ，２１６８Ａ＞Ｇ与１２２９Ｃ＞Ｔ突　变，其操作简单，成本低。且经测序技术验证，结果准确。可作为诊断遗传性疾病及产前诊断的快速有效方法。　【关键词】耳聋；前庭水管扩大；ＳＬＣ２６Ａ４基因；ＦＭＣＡ；探针熔解曲线分析技术　【中图分类号】Ｒ７１４．５　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２—２９２２（２０１５）０３—５３６—０５　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＦＭＣＡ　ｉｎ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｌａｒｇｅ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ　ａｎｄ　ｉｎ　ｐｒｅｎａｔａｌ　ａｉａｇｎｏｓｌｓ　ＧＡ０　Ｈｕｉ　，ＬｌＵ　ｊ　ｔ目　ｇｚ，ｓＨＥＮ　Ｓｈａｎｓｈａｎ　，ＬＩＡＮＧ　Ｓｈａｏｍｉｎ￣，ＷＥＩ　Ｌｉｎｇｅｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｓｈａｙａｎｌ　ｉ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＪｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａ１．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５１８０２０，Ｃｈｉｎａ　２　Ｙ０ｎｅｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｓｈｅｎｚｈｅｎ）Ｃｏ．Ｌｔａ　５１８１３３　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：　ⅣＧ　Ｓｈａｙａｎ　Ｅｍａｉｈ　ｓｈａｙａｎｗ＠ｍｈｏｏ．ｃｏｒｎ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｅｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｒｅｐｏｒｔ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＦＭＣＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｓ￡Ｃ２６　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｂｉｌａｔｅｒａ１　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ（ＥＶＡ）ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＥＶＡ　ａｎｄ　Ｓ　（　２６Ａ　ａｎｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆ０ｒ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＦＭＣＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄａｔａ　ｏｆ　ＥＶＡ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．ＩＶＳ７．２Ａ＞Ｇ．２　１　６８Ａ＞Ｇ．　１　２２９Ｃ＞Ｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５　Ｃ２６Ａ４　ｇｅｎｅ　ｉｎ　１　０７　ｎｏｒｍａ１　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ａｎｄ　ｌ　９　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｆｒｏｍ　６　ＥＶＡ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＦＭＣＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｍｅｄ　ｗｉｒｔｈ　ｄｉｒｅｃｔ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＳＬＣ２６Ａ４　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　２　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　１０７　ｎｏｒｍａ１　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｆ１．８７％）．Ｉｎ　ｔｈｅ　ＥＶＡ　ｆａｍｉｌｉｅｓ．ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＬＣ２６Ａ４　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　３　ｓｕｂｊｅｃｔｓ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　３　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａ—　ｔｉｏｎｓ　ｉｎ　１０　ｓｕｂｊｅｃｔｓ（８４．２１％），ａｎｄ　３　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｎｏ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｐｒｅｎａｔａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｉｎ　ｏｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ／１２２９Ｃ＞Ｔ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆｔｈｅ　ＳＬＣ２６Ａ４　ｇｅｎｅ．Ａ１ｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｓ—　ｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｕｒ　ｓｔｕｄｙ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ＦＭＣＡ　ｃａｎ　ｑｕｉｃｋｌｙ　ｄｅｔｅｃｔ　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ．２　１　６８Ａ＞Ｇ．１　２２９Ｃ＞Ｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ２６Ａ４　ｇｅｎｅ．Ｂａｃｋｅｄ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｏｕｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ＦＭＣＡ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｆａｓｔ．ｅｃｏｎｏｍ—　ｉｃ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｐｒｅｎａｔａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．　【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｌｏｓｓ；Ｅｎｌａｒｇｅ　Ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　Ａｑｕｅｄｕｃｔ；ＳＬＣ２６Ａ４；ＦＭＣＡ；Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｃｕｒｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｐｒｏｂｅｓ　耳聋是人类生活中常见的疾病，２００６年第二次　ＳＬＣ２６Ａ４、ＦＯＸＩ１及ＫＣＮＪ１０基因有关ｉ　～ｉ。ＳＬＣ２６Ａ４　残疾人抽样调查数据显示，我同听力残疾达２００４万，　基因是我国第二常见的致聋基因，其突变可致ＥＶＡ　占残疾人总人数的２４．１６％　，前庭水管扩大（Ｅｎ—　伴非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋（ＤＦＮＢ４）及　１．ｄｒｇｅ　Ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　Ａｑｕｅｄｕｃｔ，ＥＶＡ）是一种常见的与感　Ｐｅｎｄｒｅｄ综合症（ＰＤＳ）。　。研究发现ＳＬＣ２６Ａ４基因具　音神经性耳聋相关的内耳畸形　，１９９６年Ｇｒｉｆｉｔｈｆ　首　有种族特异性，Ｔ４１６Ｐ及ＩＶＳ８＋１Ｇ＞Ａ突变在北欧最常　次描述前庭水管扩大的家族遗传性，随后其被证实与　见，２１６８Ａ＞Ｇ突变在日本及韩国最常见，我国最常见　突变位点是ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ（９１９—２Ａ＞Ｇ），其次为　２１６８Ａ＞Ｇ、１９７５Ｇ＞Ｃ、１　１７４Ａ＞Ｔ、ＩＶＳ１５＋５Ｇ＞Ａ及　ＤＯＩ：ｌＯ．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１６７２—２９２２．２０１５．０３．０３６　基金项日：２０１３年深圳市战略新兴产业发展专项资金　（ＣＸＺＺ２０１３０５１７１４３ｌｌ　ｌ７８０）　１２２９Ｃ＞Ｔ￣　，　作者简介：高慧，硕』：研究生，研究方向：医学遗传学　通讯作者：王沙燕，Ｅｍａｉｌ：ｓｈａｙａｎｗ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｉｎ　中华耳科学杂志２０１５年第１３卷第３期　・５３７・　５ｕｌＤＮＡ用ＮａｎｏｄｒｏＤ　目前，我国耳聋的临床诊断主要平台有基因芯　步骤说明书提取ＤＮＡ。取１．片技术，飞行质谱仪及测序技术等方法　，但这些方　２０００进行ＤＮＡ纯度及浓度检测。　法操作复杂，成本较高并且需要特殊的仪器。多色　１．３制备标准品及绘制标准曲线　荧光熔解曲线分析技术（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｅｌｔ．　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ位于ＳＬＣ２６Ａ４基因ｅｘｏｎ７与ｅｘｏｎ８之　ｉｎｇ　Ｃｕｒｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＦＭＣＡ）是基于荧光ＰＣＲ熔解曲线　问的内含子上，２１６８Ａ＞Ｇ位于ｅｘｏｎｌ９，１２２９Ｃ＞Ｔ突变　平台，利用野生型和突变型模板ＤＮＡ与探针匹配的　位于ｅｘｏｎｌ０，选择优化好的引物及ＰＣＲ反应程序对　碱基数不同，获得不同的Ｔｍ值，从而进行已知突变　ＳＬＣ２６Ａ４基因ｅｘｏｎ７＋８，１０和１９进行扩增，获得ＰＣＲ　检测、基因分型及未知突变筛查　。该技术汲取了染　产物送至上海旭冠生物科技发展有限公司进行克隆　料熔解曲线Ｔｍ值分型技术及荧光ＰＣＲ多色多通道　及构建突变位点，然后将构建好的质粒进行测序验　的双重优点，对基因每个突变位置只需设计一条探　针，利用不同波长的荧光标记，即可实现多色多通道　多位点的定性检测　。目前国内外已有少量文献报　道利用熔解曲线技术分析致聋基因ｕ　１１］，但国内尚　未见到利用ＴａｑＭａｎ探针结合熔解曲线技术检测　ＳＬＣ２６Ａ４基因的报道，本文利用ＴａｑＭａｎ探针结合熔　解曲线建立快速可靠的ＦＭＣＡ诊断技术，分析１０７　例正常人，１９例ＥＶＡ家系成员的ＳＬＣ２６Ａ４基因　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ、２１６８Ａ＞Ｇ及１２２９Ｃ＞Ｔ突变位点，探讨前　庭水管扩大与ＳＬＣ２６Ａ４基因的关系及ＦＭＣＡ技术的　最优检测条件。　１资料与方法　１．１研究对象　遵循知情同意的原则，收集来自深圳市人民医　院就诊的１０７例听力正常及内耳结构无异常的人群　以及６个ＥＶＡ小家系的１９位成员。其中，家系ａ先　证者母亲腹中孕有一胎儿，共两代４人；其余家系均　为两代３人（图１）。　Ｉ　口　ｏ口－］＿ｏ　Ｉ－１　ＩＩ　¨　Ｉ　Ｉ－２　Ｉ－１　Ｉ　ＩＩｌ　Ｉ　Ｉ－２　ｖ　ＩＬｌ　ＩＩ－２　ＩＩ－１　ＩＩ－１　家系・　霉系ｂ，・，ｆ　掌系ｅ／ｄ　墨ｌ￡ｖ　嘲　，先睡青口正甥性Ｏ正常女性■男性患者●　◇未知　１．２样本采集与ＤＮＡ提取　采用ＥＤＴＡ—Ｋ２抗凝管采集所有受试者的外周　血２－３ｍｌ，胎儿基因检测选择在产妇孕中期（１７　周一２３周）抽取羊水５一ｌＯｍｌ。ＤＮＡ提取采用德国　ＱＩＡＧＥＮ公司的ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ抽提试剂盒，按照提取　证其准确性。利用构建的ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ，２１６８Ａ＞Ｇ及　１　２２９Ｃ＞Ｔ突变型质粒与野生型质粒进行ＦＭＣＡ检测，　并绘制标准曲线。　１．４方法　１．４．１引物及探针设计　应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０及Ｏｌｉｇｏ７．０设计相应位点的引物　及ＴａｑＭａｎ探针（表１），并将探针及引物在ＮＣ．　ＢＩ—ＢＬＡＳＴ上进行序列同源性比对，送至上海英潍捷　基贸易有限公司合成。　表１引物及探针序列　基因位点　类别　序列　Ｉｖ￥７－２Ａ＞Ｇ　ＰｒｉｍｅｒＦ　Ｔ　ＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＡＧＴ１ＹＩＴＩＴＡＡ　Ａ　ＰｒｌｍｅｒＲ　ＧＧＡＴＧＧＡ　Ｉ　ＩＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣ　一　ＨＥＸ—ＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＧＴＣｃ　。ｂ。　ＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡ—ＢＨＱ　１　—　２１６８Ａ＞Ｇ　ＰｒｉｍｅｒＦ　ＧＣＡＡＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＩＴｒＧＡＣＧＡＣ　ＰｒｉｒｎｅｒＲ　ＡＣｃｃＴｃ１ＴｒＧＡＧＡＴＴＴｃＡｃＴＴＧＧＴＴｃＴ　～ｂ１　，　ＦＡＭ—ＡＧＡＴＡＧＡＧＴＡＴＡＧＣＡＴＣＡｃ　。ｂ。　ＧＧＡＣＣＧＴＣＡ—ＢＨＱ　１　—　１　２２９Ｃ＞Ｔ　ＰｒｉｍｅｒＦ　ＴＴＧＴＡＧＧＡＴＣＧＴＩ１ＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ　ＰｒｉｍｅｒＲ　ＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＴＣＣ　一，　ＦＡＭ—ＣＡＣＴＧＣＴＣ１Ｙ丌ＣＣＣＧＣＡｃ　Ｆｒｏｂｅ　ＧＧＣＣＧＴＣＣＡ—ＢＨＱ１　—　１．４．２不对称ＰＣＲ反应体系及反应条件优化　２５ｕｌ反应体系：１×ｂｕｆｉｅｒ，３．０ｍＭ　Ｍｇ。　，２００ｕＭ　ｄＮＴＰｓ，２．５Ｕ　Ｔａｑ酶，２．５Ｕ　Ｔａｑ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，各上游引物　０．４ｕＭ，各下游引物０．０４ｕＭ（１２２９Ｃ＞Ｔ）２下游引物用量相　反），各ＴａｑＭａｎ探针０．４　ｕＭ，２０　ｎｇ　ＤＮＡ（５００００ｃ０ｐｉｅｓ质　粒），加蒸馏水补至２５ｕｌ。反应条件：第一步ＰＣＲ扩增：　９５ｃＩ＝预变性５ｍｉｎ；９４￣Ｃ　３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，４０　盾环；　第二步熔解曲线：９５℃ｌｍｉｎ，４０％１ｍｉｎ，以０．０１℃／Ｓ的升　温速率从４０℃升至８５℃并每升高１℃收集１Ｏ次荧光。仪　器选择：Ｒｏｃｈｅ　ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０一Ⅱ。　１．５测序验证　按照文献所述方法　将所有受试者ＤＮＡ进行　・　５３８　・　１．２　ＦＭＣＡ结果分析　ＰＣＲ扩增获得ＳＬＣ２６Ａ４基因ｅｘｏｎ７＋８，ｅｘｏｎｌ０和ｅｘ—　２．ｏｎ１９，采用ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ试剂盒将所得ＰＣＲ产物进　向测序，最后将测序结果用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行分析。　１．６统计学分析　Ｘ　ａＬＩ　Ｙ　对１０７例正常患者进行ＦＭＣＡ分析，结果显示２　！　０　ｎ　Ｂ　ｎ　０　行纯化，利用ＡＢＩ　３１３０　ＤＮＡ全自动测序仪进行正反　例存在ＩＶＳ７—２杂合突变，其余均未发现突变，突变率　为１．８７％。６个ＥＶＡ家系分析显示，来自５个家系的　１６位成员携带ＳＬＣ２６Ａ４基因突变，其中３例为　利用ＳＰＳＳ１３．０软件，选择卡方检验进行统计　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ纯合突变，８例ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ杂合突变，１例　ＶＳ７—２Ａ＞Ｇ／２１６８Ａ＞Ｇ双重杂　学分析，比较对照组与试验组之间差异有无统　２１６８Ａ＞Ｇ杂合突变，１例Ｉ计学意义。　２结果　２．１　ＦＭＣＡ结果　合突变，１例１２２９Ｃ＞Ｔ杂合突变，２例ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ／　１２２９Ｃ＞Ｔ双重杂合突变，其遗传方式均符合常染色体　隐性遗传。１个家系未检出ＳＬＣ２６Ａ４基因突变。（表２）　２．２　ＰＣＲ产物测序结果　对所有受试者的ＳＬＣ２６Ａ４基因ｅｘｏｎ７＋８，１０和ｌ９　２．１．１标准曲线的绘制　利用ＦＭＣＡ技术分析已构建好的野生型及突变　型质粒样品，获得不同的Ｔｍ的熔解曲线（图２），结果　显示：ＩＶＳ７～２Ａ＞Ｇ野生型Ｔｍ为（６１．５－－－０．５）℃，突变型　Ｔｍ为（６７．０±０．５）℃；２１６８Ａ＞Ｇ野生型Ｔｍ为（６１±　０．５）℃，突变型Ｔｍ为（６７．０±０．５）Ｃｃ；１２２９Ｃ＞Ｔ野生型　Ｔｍ为（７４．０＋０．５）　，突变型（６８．０＋０．５）℃。　＾　ＩＴＳＴ一２＾＞Ｇ　ｃ．２ｌ明＾　ｃ．１２２９　Ｃ）Ｔ　测序结果与ＦＭＣＡ技术检测结果完全一致，符合率　为１００％。（表３）　２．３统计学分析　卡方检验结果显示Ｐ＝Ｏ．Ｏ００（＜Ｄ．　），认为对照组　与实验组之间差异有统计学意义。　３讨论　翻　ｒ　ｉ　田２撵钟熔解曲线爰测序结果圈　圈Ａ：ｎＩｃＡ技术标准曲缄的建立Ｉ霹Ｂ、ｃ：利甩ｒ＇ＭＣＡ－￣囊Ｉ庳技术植删露粟ｉ胎）ＬＳＬＣ２６Ａ４　一日锖幂霉（　左至右）：ｒ，ｒＳ７．２Ａ）０杂台突变、２１种Ａ）ｏ，，生型矗１２２９Ｃ＞Ｔ杂台突变　ＳＬＣ２６Ａ４基因与前庭水管扩大伴非综合征型常　染色体隐性遗传性耳聋密切相关，并且各国及种族　之间有较大的差异，高加索人约有４０％前庭水管扩　大相关内耳畸形（ＥＶＡ和Ｍｏｎｄｉｎｉ畸形）患者携带有　ＳＬＣ２６Ａ４基因突变，日本约有７８％，韩国约有９２％；而　我国则有９７．９％，其中ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ最常见（５７．６３％），　只有２．１％患者无ＳＬＣ２６Ａ４突变　。２０１４年解放军总　医院学者研究２６８６例就诊患者，结果显示ＳＬＣ２６Ａ４　基因致病突变全部在前庭水管扩大相关内耳畸形病　表２　ＥＶＡ家系分析　按照世界卫生组织（ＷＨＯ一１９９７）听力残疾分级标准　中华耳科学杂志２０１５年第１３卷第３期　・５３９・　人中检出Ｉ１４１；并且双侧前庭水管扩大或单侧前庭水　据分析等难题　，导致新一代测序技术从实验室到临　管扩大与ＳＬＣ２４Ａ６基因的关系有明显的不同，双侧前　床应用还有较长一段路程。而ＦＭＣＡ分析技术　基　庭水管扩大ＳＬＣ２６Ａ４基因突变检出率为９５．９７％，而　于荧光ＰＣＲ，操作简单，结果可靠，更加便于在医院实　单侧仅为２９．４１％　。本文研究中正常样本人群共　施；目前已在临床上实现Ｂ一地中海贫血２４个突变位　１０７人，有２例ＳＬＣ２６Ａ４单等位基因突变，并且为最常　点检测　，Ｇ６ＰＤ基因ｌ６个突变位点分析　及结合杆　见的ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ突变，突变率为１．８７％，与其他文献　菌耐药性检测　等遗传病及病原体的诊断。本实验　所报道的人群突变率基本一致　。６个ＥＶＡ家系先　即是利用ＴａｑＭａｎ探针及不对称ＰＣＲ体系，建立快速　证者听力学检测均为双耳重度或极重度感音神经性　可靠的ＦＭＣＡ技术检测５　Ｃ２６Ａ４基因，结果显示　耳聋，其中５例基因检测为纯合突变或复合杂合突　ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ野生型Ｔｍ与突变型Ｔｍ相差（△Ｔｍ）约　变，１例无突变检出；所有家系成员基因检测结果显　５．３℃；２１６８Ａ＞Ｇ的ＡＴｍ约６．５℃；１２２９Ｃ＞Ｔ的ＡＴｍ约　示８４．２１％携带ＳＬＣ２６Ａ４基因突变，其中ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ　６ｃｃ。可见野生型与突变型Ｔｍ值相差约５ｃ【＝以上，易　突变频率最高，由于阳性样本量较小所以突变率与其　于分型，结果简单易读，通过测序验证显示其符合率　他文献相比会有少许偏倚，经统计学分析显示试验组　为１００％。一般认为熔解曲线分析应选用不被水解的　与对照组的突变率差异有统计学意义，认为ＥＶＡ家　探针，如利用杂交探针结合熔解曲线分析载脂蛋白Ｅ　系携带ＳＬＣ２６Ａ４基因突变率高于正常人群。其中家　基因型　；运用碱基淬灭探针结合熔解曲线技术分　系ａ中ＩＩ　一２为孕中期胎儿，基因检测为ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ／　析线粒体ＤＮＡ　１２ＳｒＲＮＡ的１５５５Ａ＞Ｇ与１４９４Ｃ＞Ｔ突　１２２９Ｃ＞Ｔ复合杂合突变（图２ＢＣ）；Ｉ　一１与Ｉ　一２均为　变　”。本研究选用普通的ＴａｑＭａｎ水解探针，较其他　杂合突变，临床表型正常，Ⅱ　一１为复合杂合突变，临　探针设计简单，合成方便及成本低，且在熔解曲线分　床表型为极重度感音神经性耳聋伴双侧前庭水管扩　析中不受Ｔａｑ酶影响　，并可获得较高的熔解曲线峰　大，根据文献报道　】及常染色体隐Ｉ生遗传规律推断该　值；但其要注意试验成功的关键条件：（１）探针的设　胎儿极有可能是聋儿。本研究家系ｅ在ＳＬＣ２６Ａ４基　计：选择较低特异性、能与野生链及突变链有效结合　因ｅｘｏｎ７＋８，１０和１９上均无突变；由于耳聋可由多种　的探针，一般探针长度较长（表１）；探针突变碱基为Ｃ　因素导致，并且ＳＬＣ２６Ａ４基因突变位点已报道上百种　（Ｃ—Ｇ／Ａ）的ＡＴｍ大于Ｔ（Ｔ—Ｇ／Ａ）（图３ＡＢ），更适用于　（ｈｔｔｐ：／／ｄｅａｆｎｅｓｓｖａｒｉａｔｉｏｎｄａｔａｂａｓｅ．ｏｒｇ／），ＳＬＣ２６Ａ４基因　杂合子分析。（２）不对称ＰＣＲ：引物比为１０：１体系优　常见的突变位点不足以确定该家系致聋原因，所以家　于１：１的体系（图３）。（３）实验显示Ｔｍ值存在批问差　系ｅ的致聋原因仍需要近一步研究。　异，每次实验必须建立标准曲线。　目前，新一代测序技术已成为单基因遗传病检　测的热门方法，也是全球普及的高通量测序技术，可　并行对几百万个ＤＮＡ分子同时测序，快速筛选致病　基因及未知突变　。２０１０年新一代测序技术已成功　应用于耳聋相关新基因的筛选　；同年，Ｓｈｅａｒｅｒ等　９　ｌ成功地将新一代测序技术应用于耳聋基因的临床检　测。近年来，耳聋相关新基因及新突变位点的发现数　ｌ唧ｅｒＩｔ１Ｉｒｅ（℃）　量呈直线上升与新一代测序技术的应用及发展密不　ｃＡ技术优化　可分　。但由于仪器昂贵、捕获目的区域的偏倚及数　搽恢翔遥趣｛　＾）ｌ：秣｝突；ｌＩ逗为ｆ（Ｔ吲＾）　ｃ：对称鹏不对｝｝ｍ（ａ）ｊｌ１｝Ｉ比ｌ０：１（ｂ）ｊｌ１；Ｉ比ｉ：１（ｃ／ｄ）阴性２ｊ照　表３　ＦＭＣＡ方法检测ＳＬＣ２６Ａ４基因的评价　・５４０・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｎｆＯｔｏｌｏｇｙ　ＶｏＩ．Ｉ３，Ｎｏ．３，２０１５　前庭水管扩大伴非综合征型常染色体隐性遗传　性耳聋与ＳＬＣ２６Ａ４基因密切相关，利用ＦＭＣＡ平台成　功检测ＳＬＣ２６Ａ４基因的ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ、２１６８Ａ＞Ｇ与　１０　Ｍｅｒｃｅｒ　Ｓ．Ｍｕｔｔｏｎ　Ｉ　．Ｄａｈｌ　Ｈ　Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｉｉｃａｔｉ０ｎ　ｏｌ　Ｓｔ　Ｃ２６Ａ４　ｍｕｔａｔｉｎｎｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｌｏｓｓ　ａｎｄ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ　ｕｓｉｎｇ　ｈｉｇｈ—ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｅｕｒｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．［Ｊ１．Ｇｅｎｅｔ　Ｔｅｓｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｍａｒｋ—　ｅｒｓ，２０１　１，１５ｆ５）：３６５－３６８．　１２２９Ｃ＞Ｔ突变，其操作简单，成本低；且经测序技术　验证，符合率为１００％；可作为诊断遗传性疾病及产　前诊断的快速有效方法。由于本实验纳入阳性样本　１　１　郑璐，罗光华，张俊，等．碱基淬灭探针技术单管检测线粒体　ＤＮＡ　Ｉ２Ｓ　ｒＲＮＡ　ＡＩ５５５Ｇ及Ｃ１４９４Ｔ突变『Ｊ１．中华耳鼻咽喉头颈外　科杂志，２Ｏ　１　２，４７ｆ４）：３２６—３２９．　１２沈姗姗，徐志勇，刘明，等．遗传性耳聋患者的ＳＬＣ２６Ａ４基因热血　突变检测『Ｊ】．中国妇幼保健，２０１　１，２６（１７）：２６４７—２６４９．　量过少，并且检测位点局限，实现高通量多位点的　ＦＭＣＡ技术仍需要进一步加深研究。　参考文献　２００６年第二次全国残疾人抽样调查主要数据公报Ｉ　Ｊｌｌ中圉康复　理论与实践，２００６，１２ｆｌ２）：１０ｌ３．　２　Ｙｕａｎ　Ｙ，Ｇｕｏ　Ｗ，Ｔａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ—　ａｌ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ａｌｌｅｌｉｅ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｏｆ　ＳＬＣ２６Ａ４　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｙｍｔｒｏｍ—　ｉｅ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｌｏｓｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．　『Ｊ１．ＰＬｕＳ　Ｏｎｅ，２０１２　７ｆ１　ｌ１：ｅ４９９８４－３　Ｇｒｉｆ＝ｆｉｔｈ　Ａ　Ｊ，Ａ　ｒｔｓ　Ａ，Ｄｏｗｎｓ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｆａｍｉｌｉａｌ　ｌａｒｇｅ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅ—　ｄｕｃｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．…．１，ａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，１９９６，１０６（８１：９６０—９６５．　４　Ｅｖｅｒｅｔｔ　Ｌ　Ａ，（；ｌａｓｅｒ　Ｂ，Ｂｅｃｋ　Ｊ　Ｃ．ｅｔ　ａ１．Ｐｅｎｄｒｅｄ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｉｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｓｕｌｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ（ＰＤＳ）．［Ｊ１．Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ，１９９７，１７ｆ４）：４１　Ｊ－４２２．　５　Ｙａｎｇ　Ｔ，Ｖｉｄａｒｓｓ（ｍ　Ｈ，Ｒｏｄｒｉｇ（）一Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ＳＩ　Ｃ２６Ａ４　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｐｅｎｄｒｅｄ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｎｄ　ｎｏｎｓｙｎ—　ｄｒｏｍｉｅ　ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ　ｎｆ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ（ＤＦＮＢ４）　ＩＪ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，２００７，８０（６）：ｌ０５５—１０６３．　６　Ｙａｎｇ　ｒ，Ｇｕｒｒｏｌａ　Ｊ　Ｎ，Ｗｕ　Ｈ　ｅｔ　ａ１．Ｍｕｔａｔｉ（）ｎｓ　ｏｆ　ＫＣＮＪ１０　ｔｏｇｅｔｈｅｒ　ｗｉｔｈ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＳＩ　Ｃ２６Ａ４　ｃａｕｓｅ　ｄｉｇｅｎｉｅ　ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｌｏｓｓ　ａｓ　ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｃｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．１　ＪＩ．Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　（，ｅｎｅｔ　２００９　８４（５）：６５　１—６５７．　７　Ｗａｎｇ　Ｑ　Ｊ　Ｚｈａ（）Ｙ　ｌ　，Ｒａｏ　Ｓ　Ｑ．ｅｔ　ａ１．Ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ＳＩ　Ｃ２６Ａ４　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ａｑｕｅｄｕｅｔ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．１Ｊ１．Ｃｌｉｎ　Ｇｅｎｅｔ，２００７，７２（３）：２４５—２５４．　８　高慧，工沙燕．非综合征型遗传性耳聋基凶及分于诊断研究进　展…．中国优生　遗传杂志，２０１５，２３（２）：１２５—１２７．　９　Ｈｕａｎｇ　Ｑ，Ｌｉｕ　Ｚ，Ｉ　ｉａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｅｈｉｎｇ　ｅｕｒｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｉ）ｒ　ｎｍｔａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｅｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｕａｌ—ｌａｂｅｌｅｄ，ｓｅｌｆ－ｑｕｅｎｃｈｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ．ＩＪｊ．ＰＩ　ｏＳ　Ｏｎｅ，２０１　１，６（４）：ｅ１９２０６．　１３孙喜斌．第二次全国残疾人抽样调杏听力残疾标准的制定ＩＪＩ．ｒｌｌ　圈听力语言康复科学杂志，２００７，（１）：１０—１３．　１４孙宝春，代志瑶，黄莎莎，等．ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４基凶致病性突变　内耳ｃＴ表型关系的研究ｌＪｌ＿中华耳科学杂志，２０１４，１２（１）：３０—３３　１５黄莎莎，黄邦清，董敏，等．单侧大前庭水管综合征ＳＩ　Ｃ２６Ａ４基　的突变分析ＩＪ】．中华耳科学杂志，２０１４，１２（１）：１９—２２．　１　６　Ｙｕａｎ　Ｙ，Ｙｏｕ　Ｙ，Ｈｕａｎｇ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｍｏｌｅｅｕｌａｒ　ｅｔｉｏｌｏｇｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｅ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｙｐｉｃａｌ　ａｒｅａｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．Ｉｌ１．Ｊ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，２００９，７：７９．　１７袁慧军，卢宇．新一代测序技术在遗传性耳聋基凶研究及诊断【Ｉ１　的应用ｌＪ１．遗传，２０１４，３６（１　１）：ｌ】ｌ２—１　１２０．　１８　Ｒｅｈｍａｎ　Ａ　Ｕ，Ｍｏｒｅｌｌ　Ｒ　Ｊ，Ｂｅｌｙａｎｔｓｅｖａ　Ｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｃａｐｔｕｔ，ｅ　ａｎｄ　ｎｅｘｔ～ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　Ｃ９ｎｒｆ７５，ｅｎｅ（）ｄｉｎｇ　ｔａ—　ｐｅｒｉｎ，ａｓ　ｔｈｅ　ｎｍｔａｔｅ（１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｅ　ｄｅａｆｎｅｓｓ　ＤＦＮＢ７９．【ＪＩ　ｌＡｍ　Ｊ　Ｈｕｎｌ　Ｇｅｎｅｔ，２０１０，８６（３）：３７８—３８８．　１　９　Ｓｈｅａｒｅｒ　Ａ　Ｅ，Ｄｅｌｕｅａ　Ａ　Ｐ，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ　Ｍ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｇｅ—　ｎｅｔｉｃ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｈ）ｓｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍａｓｓｉｖｅｌｙ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｅｉｎｇ．１Ｊ１．Ｐｒｏｅ　Ｎａｔ］Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２０１０，１０７（４９）：２ｌｌＯ４—２１　１０９．　２０　Ｘｉｏｎｇ　Ｆ，Ｈｕａｎｇ　Ｑ，Ｃｈｅｎ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ＣＨＩＶｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ－一ｔ）ａｓ（　ｄ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｏｎｅ——ｓｔｅｐ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ｂｅｔａ——ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａ　ｍｕｈｉｃｅｎｔｅｒ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．　１ＪＩ．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｄｉａｇｎ，２０１　１，１３（４）：４２７～４３５．　２１严提珍，钟青燕，唐宁，等．多色探钊　荧光ＰＣＲ熔解ｌＨＩ线法在　Ｇ６ＰＤ基因突变检测中的临床应用评价Ｉ　ＪＩ＿ｒ”华医学遗传学杂　志，２０１４，３１（２）：１５６～１６２．　２２　Ｈｕ　Ｓ，Ｌｉ　Ｇ，Ｌｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｎｎｉａｚｉｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｙ－　ｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ—ＰＣＲ—１）ａｓｅ（１　ｎｉｃｈｉｎｇ　ＣＨＩＶｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉ　ＪＩ＿Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４，５２（５）：１６４４—１６５２．　２３樊锦秀，朱慧民，张黎明，等．杂交探针技术结合熔解｝ｍ线快速检　测载脂蛋白Ｅ基冈型ｌ　Ｊｌｌ中华检验医学杂志，２００８，３１（２）：　１５２－１　５８　（收稿日期：２０１５—１—２９审核人：郭维维）