齐齐哈尔医学院学报２０１０年第３１卷第８期 异氟醚对心肌细胞超微结构及ＣＸ４３蛋白表达的 保护作用 倪 燕 朱莉莉 蒋秀红 丁正年 张国楼 【摘要】 目的 观察异氟醚预处理对缺血／再灌注心肌细胞超微结构及ＣＸ４３蛋白表达的保护作 用。方法 连续观察５４例心脏瓣膜疾病接受瓣膜置换的病人，随机分为观察组（异氟醚处理）和对照组 （非异氟醚处理）。体外循环前后剪取右心耳组织标本处理，电子显微镜下观察心肌细胞超微结构的变 化，免疫组化方法测定心肌纤维ＣＸ４３蛋白表达水平，并作图像定量分析。对比手术前后超声心动图心 功能指标。结果观察组心肌细胞线粒体和闰盘结构基本完整，ＣＸ４３表达水平稳定。对照组心肌细胞 超微结构破坏严重，ＣＸ４３表达水平明显降低（Ｐ＜０．０５）。结论异氟醚能维持体外循环后心肌细胞 ＣＸ４３蛋白表达的稳定，保护了心肌细胞超微结构的完整性，有利于术后心功能恢复。 【关键词】心肌保护 异氟醚ＣＸ４３线粒体 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｓｏｆｌｏｒａｎｅ ｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＪ Ｙ ｎ。 ａ１． （Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１０００９ ｔｈｅ Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉ０ｎｉｎｇ ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｙｏ— ｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ５４ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（ｗｉｔｈ Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｎｏｎ Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ） ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ．Ｒｉｇｈｔ ａｔｒｉａｌ ａｐｐｅｎｄａｇｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｅｖｅｒｙ ｃａｓｅ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏ‘ ｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｉｃ ａｐ— ｐｒｏａｃｈ ｗｉｔｈ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｒｙ ｄｉｓｃ ｗｅｒｅ ｂａｓｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｍｏｒｐｈｏ－ ｌｏｇｉｃ ｎｏｒｍａｌ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｄｉｓ０ｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｉｓｏｆｌｕ－ ｒａｎｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅｔａｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＣＸ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ｉｓｅｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｅｖｅｎｔ． Ｉｔ ｍａｋｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ＣＸ４３ 近年来，随着心脏外科手术技术进展。心肌缺血一再灌注 损伤（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｉｕｒｙ，ＭＩＲＩ）成为困扰 ０．１ ｍｇ／ｋｇ。异氟醚组以芬太尼复合异氟醚维持麻醉，于主动 脉阻断前吸人１．１％异氟醚３０ ｍｉｎ以上；洗脱１５ ｍｉｎ。对照 组以芬太尼维持麻醉，血药浓度以平均动脉压（ＭＡＰ）的变化 调节（基础值士２Ｏ ）。两组均间断静脉注射维库溴铵维持肌 临床医生的难题，并日益引起人们的重视。自从１９８６年 Ｍｕｒｒｙ等首次报道多次短暂的缺血能使心脏对随后较长时间 缺血产生较强的耐受力，且能明显减少心肌梗死面积，并由此 提出了缺血预处理（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，１Ｐ）的概念，人们相 继发现许多麻醉药物预处理也具有相似的心肌保护作用，这 为心肌保护的临床应用开辟了新的途径『１］。本研究拟观察异 氟烷预处理对心脏换瓣术后患者围术期血浆ＣＸ４３蛋白表达浓 度及心肌超微结构的影响，评价其对心肌的保护作用，为临床实 践中应用麻醉药物预防及治疗体外循环后的心肌损伤提供证据。 １资料与方法 松。手术前和手术后７天作彩色多谱勒超声心动图检查左心 室射血分数（ＥＦ）和收缩缩短率（ＦＳ）。观察记录围术期心功 能和心律失常发生情况。 １．３ 心肌活检两组病例均在体外循环转流前和心脏再灌 注血流动力学指标稳定２０ｍｉｎ后；剪取适量未损伤的右心耳 组织。分别作电子显微镜观察心肌细胞超微结构形态学变化 观察和心肌细胞ＣＸ４３免疫组化测定，以德国ＫＯＮ＇Ｉ、ＲＯＮ ＩＢＡｓ ２．５全自动图像分析系统和日本ＪＶＣ ｋｙ—Ｆ３ＯＢ—ＣＣＤ １．１ 一般临床资料 连续观察慢性风湿性心脏瓣膜病接受 心脏瓣膜置换手术治疗的患者５４例，男３１例，女２３例，年龄 ５５～６５岁。均为二尖瓣置换术。术前超声心功图以及心电 图检查心脏大小、肥厚程度以及心功能状况无明显差异。术 前均无冠状动脉供血异常的表现。 ｌ＿２麻醉及研究方法 患者均被告知并同意接受本研究观 察。随机分为两组：随机分为异氟醚组（”一２８）和对照组 彩色图像摄录输入仪进行图像分析，并计算ＰＵ阳性单位。 １．４统计分析ＳＰＳＳ １ｌ１ ０统计软件包处理，采用两独立样 本的ｔ检验，检验水准为ａ一０．０５。 ２ 结果 ２．１ 一般资料统计结果 全组无住院期死亡 两组间的年 龄、体重、身高、术前心功能分级、总住院时间、主动脉阻断时 间、心肺转流时间、术中最低鼻咽粘膜温度、术中抗心律失常 （ 一２６），两组患者麻醉诱导用药相同，均为异丙酚静脉 ＴＣＩ，目标血浆浓度为２ ｍｇ／Ｉ ，静注芬太尼５／￣ｇ／ｋｇ，维库溴胺 作者单位：江苏省人民医院麻醉科（南京） 药物使用等差异均无显著性（Ｐ＞０．０５）。观察组术中心脏自 动复跳率、术后心功能恢复和心律失常发生均明显优于对照 组（Ｐ＜０．０５）。 ２．２免疫组化检测结果 邮 编２１０００９ 收稿日期２０１０—０２—１７ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｑｉｑｉｈａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．８ ２．２．１ 心肌细胞超微结构的电镜观察 见图１～２。观察 联，细胞间的传导性下降６Ｏ 。Ｐｅｔｅｒｓ等∞ 发现缺血心肌边 组：线粒体膜基本完整，体嵴密集，电子密度高，无空泡形成， 缘的细胞问缝隙连接分布紊乱是心电“折返环”形成重要因 闰盘结构基本正常、连续，心肌纤维结构基本正常。对照组： 素。本研究发现：异氟醚能使这种ＣＸ４３脱磷酸化和细胞间 心肌细胞线粒体肿胀，线粒体膜模糊不清，破裂；线粒体嵴明 的电失偶联终止，通过心肌细胞ＣＸ４３荧光点数和面积增加、 显疏松溶解，大量空泡形成；闰盘结构不连接，断裂，崩解。心 ＣＸ４３磷酸化／非磷酸化比例的增加，有利于心肌同步收缩的 肌纤维坏死，挛缩，排列紊乱，肌丝Ｚ线增宽，其它各结构带模 建立，减轻自律性异常而引起的缺血／再灌注心律失常的发 糊，部分肌纤维断裂。 生，使之能耐受随后的持续缺血。 线粒体是细胞产生和储存ＡＴＰ的“动力工厂”，在调节细 ■■ 胞渗透压、钙稳态、ｐＨ值和细胞信号转导等方面起重要的作 用。线粒体的损伤直接与细胞凋亡的启动有关。凋亡细胞的 线粒体向核周聚集，空泡样肿胀，线粒体体嵴减少或消失，释 放出膜间腔内的凋亡蛋白调节物，引起群发性细胞凋亡，手术 后的心功能明显受到抑制。研究证实过量钙离子进入线粒 体，干扰线粒体氧化磷酸化过程，致心肌细胞能量代谢障碍。 图１ 图２ 钙离子激活磷脂酶，促进膜结构磷脂水解，造成细胞膜及细胞 图１观察组：阉斑结构较完整、连续 圈２对照组：闰盘紊乱、不连续、断裂 器损伤。Ｋｒｏｌｉｋｏｗｓｋｉ ＪＧ等Ｌ９ 用异氟醚对离体大鼠心脏缺血 ２．２．２心肌细胞ＣＸ４３蛋白阳性表达和图像分析见图３～ 后处理发现，其心肌保护作用与抑制线粒体通透性转换孔 ４。观察组：术前（２１．５７士８．２１）ＰＵ，术后（１６．１５±４．４０）ＰＵ。 （ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｏｒｅ，ｍＰＴＰ），激活 组化染色上可见ＣＸ４３棕褐色斑片状颗粒清楚。对照组：术 ＡＴＰ敏感性Ｋ通道有关 本研究中，观察组线粒体肿胀、空泡 前（２６．５７士３．９１）ＰＵ，术后（１１．９２±１．２６）ＰＵ。ＣＸ４３棕褐色 化、脊断裂、肌丝排列紊乱均较对照组减轻。异氟醚预处理可减 斑片状颗粒不明显。统计显示：术前两组心肌ＣＸ４３表达无 少钙离子内流及心肌顿抑时细胞内钙离子浓度，不仅抑制钠／钙 明显差异（Ｐ＞０．０５）。术后观察组Ｃｘ４３表达无明显变化 交换；还与Ｌ型钙通道结合，减少钙内流，而使细胞内钙减少。 （Ｐ＞０．０５）；而对照组明显下降（Ｐ＜０．０５），术后两组ＣＸ４３ 异氟醚能稳定心肌细胞ＣＸ４３蛋白的表达，保护心肌细 表达有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。 胞线粒体和连接装置等基本细胞超微结构，减少缺血／再灌注 损伤，有利于心脏瓣膜置换术后心功能的恢复，改善心肌对缺 血的耐受性。应用于心脏外科手术，可提高心肌保护水平，扩 大心脏手术的适应症，降低心脏手术死亡率，减少术后并发 症，改善术后心脏功能恢复，提高疗效为临床探索防治心肌缺 血的方法提供了新的思路和途径。 参考文 献 ［１］李进，袁世荧，丰新民，诱导型一氧化氮合酶在异氟醚延迟相预 图３ 处理心肌保护中的作用［Ｊ］．临床麻醉学杂志，２００８，２４（１０）： 圈３观察组：ＣＸ４３棕褐色斑片状颗粒清楚 ６７６—６７８ 豳４对照组：ＣＸ４３棕褐色斑片状颗粒不清楚．比术前明显减少 ［２］Ｓｃｈｕｈ Ｒ，Ｈｅｕｓｃｈ Ｇ．Ｃｏｎｎｅｘｉｎ ４３（Ｃｘ４３）ｉｎ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎ— ２．３术前后超声心动图检查手术前两组间ＥＦ和ＦＳ无明 ｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｊ Ｓ Ａｆｒ，２００４，１５（４ Ｓｕｐｐｌ １）：ｓ６ 显差异（Ｐ＞０．０５）。术后观察组ＥＦ和ＦＳ无显著性变化 ［３］刘学胜，张健，张野，等．吸人异氟醚或地氟醚预处理对心内直视 （Ｐ＞Ｏ．０５）；对照组ＦＳ明显下降（Ｐ＜０．０５），观察组明显高 手术小儿围术期心肌的保护作用［Ｊ］．中华麻醉学杂志，２００５，２５ 于对照组（Ｐ＜０．０５）。观察组术后ＥＦ值高于Ｂ组，统计结 （６）：４６５～４６６ 果（Ｐ一０．０６９＞０．０５）。 ［４３胡明伦，姜晓芬，张东琦．异氟醚预处理对心脏瓣膜置换术病人 ３讨论 ， 血清心肌肌钙蛋白与心肌酶学的影响［Ｊ］．中华麻醉学杂志， 心肌细胞线粒体和连接装置结构的损伤引起细胞间电偶 ２００３，２３（６）：４２４—４２６ ［５］Ｂｏｅｎｇｌｅｒ Ｋ，Ｄｏｄｏｎｉ Ｇ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｓｉｎｏｖａｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｎｅｘｉｎ 联、电与化学信息交换通道的变化和能量代谢障碍，其结果是 ４３ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｂｙ ｉｓｃｈｅｍｉｃ 心肌电生理和收缩力的变化＿＿２ 。心肌细胞缺血／再灌注损伤 ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ，２００５，６７（２）：２３４—２４４ 的亚细胞成分和超微结构改变导致术后心律失常和心功能恢 ［６］Ｇｒｏｓ ＤＢ，Ｊｏｎｇｓｍａ｝ＩＪ．Ｃｏｎｎｅｘｉｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅａｒｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ 复不良等问题倍受临床关注。异氟醚对心肌缺血／再灌注损 ［Ｊ］．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１９９６，１８：７１９—７３０ 伤有保护作用 ］，但从结构蛋白ＣＸ４３和细胞超微结构表 ［７３ Ｍｏｒｌｅｙ ＧＥ，Ｖａｉｄｙａ Ｄ，Ｓａｍｉｅ ＦＨ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎ— 达的角度进行临床观察的报告不多。 ｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ＣＸ４３ 心肌细胞缝隙连接结构是细胞间活动协调的功能单位。 ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏ— 主要分布在闰盘结构的ＣＸ４３是哺乳类动物心肌细胞最主要 ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９９，】Ｏ：１ ３６１—１ ３７５ 的缝隙连接蛋白［５］，其表达和分布的异常表示细胞间连接结 ［８］Ｐｅｔｅｒｓ ＮＳ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｔｏｓｅ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ，１９９５，３；３７５—３８６ 构的破坏和功能紊乱；是产生心脏手术后心律失常和导致心 ［９］Ｋｒｏｌｉｋｏｗｓｋｉ ＪＧ，Ｂｉｅｎｅｎｇｒａｅｂｅｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎ— 功能不全的解剖学基础或高危因素 ］。基础状态下心肌细胞 ｄｒｉａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏ— 的ＣＸ４３处于磷酸化状态，维持细胞电耦联的正常和心室肌 ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ 舒缩协调；心肌缺血时；ＣＸ４３快速地脱磷酸和脱耦联。Ｍｏｅ－ ＫＡＴＰ ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ，２００５，１０１（６）：１ ５９Ｏ一１ ５９６ ｌｅｙ等ｒ７ 发现；ＣＸ４３缺陷鼠的心肌细胞仅在低水平存在电耦