SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程

----(纯度检测)

一. 目的：

检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二. 依据：

《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：

质量控制部。

四. 试剂与水：

所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：

所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。 tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：

电泳仪（电源1--300V） 电泳槽 灌胶模具 染色具 凝胶扫描仪

七. 环境要求：

相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：

1. A液：1.5MTris·HCl pH8.8

称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。贴上标贴，4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

2. B液: 1MTris·HCl pH6.8

称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。贴上标贴，4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 3. C液: 30%丙烯酰胺

称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。贴上标贴，避光4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 4. D液:10%SDS

称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 5. E液:10%过硫酸胺

称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。贴上标贴，-20℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 6. F液:TEMED(amersco) 7. 电泳缓冲液(10X)

称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 8. 2X样品缓冲液（还原性）

称取4gSDS(分析纯)，0.2g溴酚蓝(分析纯)，加20ml甘油(分析纯)，10ml 1MTris·HCl pH6.8，10mlβ-巯基乙醇(分析纯)，加超纯水溶解至100ml，贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 9. 考马氏亮蓝染色液

称取1g考马氏亮蓝R－250(分析纯)，200 ml甲醇(分析纯)，50ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水至溶解至500ml, 贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液

配置台帐见附件） 10. 考马氏亮蓝脱色液

量取2250ml乙醇(分析纯)，500ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水溶解至5000ml, 贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） 11. 6X样品缓冲液（还原性）

称取12gSDS(分析纯)，0.6g溴酚蓝(分析纯)，加40ml甘油(分析纯)，10ml 3MTris·HCl pH6.8，30mlβ-巯基乙醇(分析纯)，加超纯水溶解至100ml，贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）(-20C储存,有效期可能会更长) 12. 银染试剂

a) 固定液：量取250ml甲醇(分析纯)，60 ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水至500 ml, 贴

上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） b) 漂洗液：量取100 ml乙醇(分析纯)，50 ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水至1000 ml, 贴

上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） c) 辅染液：称取10g重铬酸钾(分析纯)，2 ml硝酸(分析纯)加适量超纯水溶解，定容

至200 ml。用前40倍稀释。 贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

d) 银染液：称取2.04g硝酸银(分析纯)加超纯水溶解至1000ml , 贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

e) 显色液：量取0.5ml 甲醛(分析纯),30g碳酸钠(分析纯)加适量的超纯水,定容至

1000ml, 贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件） f)

终止液：量取10ml冰醋酸(分析纯)加超纯水至1000ml, 贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

九. 标准品（or 对照品）：

标准品:Fermentas公司蛋白质分子量标准品＃sm0671、＃sm0441,4℃保存。(为什么不保存在-20C?)

十. 标准品验证：

1. 对不同批次的标准品进行各条带迁移率的验证。

a) 将上一批合格的标准品与新一批标准品一起电泳判断各条带的迁移率是否一致。

十一．程序： 1. 制胶

1.1 配胶装板：

1.1.1 以一块塑料片、一块厚玻板、一块薄玻板的顺序装入制胶器各装12块（装

板都往左上方向按） 1.1.2 装上盖子，对称拧紧螺母 1.2 制备分离胶：（100ml，12块凝胶的量）

凝胶浓度 总体积 超纯水 30%丙烯酰胺 1.5MTris·HCl pH8.8 试液/ml 1MTris·HCl pH6.8 10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED

注：分离胶浓度与分离范围关系：

凝胶浓度% 6 8 12 分子量范围kDa >250 70-250 30-70 分离胶 8％ 100ml 46.4 26.6 25 1 1 0.06 12% 100ml 33 40 25 1 1 0.04 15% 100ml 25 50 25 1 1 0.04 浓缩胶 5％ 30ml 20.5 05 3.75 0.3 0.3 0.03 15 <30

1.3 灌入分离胶后，再灌入无水乙醇(不是水?)至液面平，避免气泡。

1.4 待分离胶聚合（约45min）后，倒去无水乙醇并用纯水冲洗，用滤纸吸去残留的纯

水，再加入浓缩胶（配方见上表），根据需要插入样品梳，避免气泡出现。

1.5 30min后待浓缩胶聚合后便可使用（如果暂时不使用装入密封袋加入适量的1×电

泳缓冲液于4℃保存，最长保存一周，下次使用时取出胶室温平衡30min后方可使用）

2

电泳装板： 2.1 拔出样品梳

2.2 将薄板装入铂金丝装入电泳槽。

2.3 将1×电泳缓冲液倒入电泳槽（阴极液的液面应高于进样孔，阳极液的

液面应在槽的2/5的高度）。 3. 样品处理：

3.1 将样品放在振荡混匀器上混匀30s，如果混不匀的应使用200ul移液枪将样品反复

吹打直至充分混匀。（如有难溶沉淀,12000rpm/min 5min离心取上清） 3.2 根据之前蛋白含量检测结果，蛋白浓度>0.8mg/ml的50ul样品加入50ul 2×还原缓

冲液，蛋白浓度<0.8mg/ml的50ul样品加入10ul 6×还原缓冲液 3.3 将样品放在振荡混匀器上混匀10s,放入100℃水浴锅10min 3.4 12000rpm/min离心5min

4. 加样：在加样孔中加入处理好的样品加样量以及加样顺序如下：

点样顺序&浓度要求：（以三个样品为例）

M 1 2 3 1 2 3 bsa bsa bsa

2ug 10ug 1ug 5ug 10ug

注：分子量检测上样量为2～3ug/孔，纯度检测上样量为>10ug/孔

5. 电泳：接通电源，先恒压100V开始电泳，30min后将电压调至1500V(!!!)，（让溴芬蓝

跑到，但不能跑出去） 6. 染色：

6.1 考马氏亮蓝法（一块胶的量）

6.1.1 染色：

6.1.2 将跑完电泳的胶拨下泡入200ml考马氏亮蓝染色液 6.1.3 放入微波炉高火加热1min

6.1.4 放在摇床上以25rpm/min染色30min 6.1.5 脱色：

6.1.6 倒去染色液倒入150ml脱色液 6.1.7 放入微波炉高火加热1min

6.1.8 再放在摇床上以25rpm/min脱色30min

6.1.9 倒去脱色液再重新倒入150ml新鲜脱色液，继续脱色1h 6.1.10 倒去脱色液再重新倒入150ml新鲜脱色液，继续脱色1h 6.1.11 倒去脱色液让胶保存在水中。 6.2 银染：（一块胶的量）

6.1.1 固定：将做完电泳的凝胶取下用超纯水漂洗２秒,再将凝胶浸入固定液中,在

摇床上缓慢摇动5min,使胶泛白．

6.1.2 辅染：将固定完的胶用超纯水漂洗２秒，倒去水加入辅染液在摇床上缓慢摇

动１０min．

6.1.3 清洗：倒去辅染液，用超纯水清洗３次，每次５min．（洗去有机物与盐，使

胶与水有一种融合的感觉．）

6.1.4 银染：倒去超纯水，加入银染液在摇床上缓慢摇动１０min． 6.1.5 清洗：倒去银染液用超纯水漂洗２秒． 6.1.6 显色：将胶浸入显影液中显色１０min． 6.1.7 终止：加入终止液终止。

十二. 结果计算与分析：

电泳凝胶经扫描交于相关负责人进行纯度、分子量分析,纯度应大于90%，分子量应为理论值的±10％才能制备抗体。

十三. 注意事项：

1. 样品：样品上样应吸取处理后的上清，避免吸底部的沉淀物。 2. 拖尾,纹理现象:需离心或降低胶浓度； 3. 蛋白带过宽:上样量过多。 4. 丙稀酰胺有毒性,配胶时需戴手套；

5. 蛋白质与SDS(浓度>1mmol/L)结合重量比1:1.4,为充分结合重量比为1:4或1:3，

B-ME终浓度为4-5%。

6. 因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点故溶解时须加入少量的水待溶解后定容。配置时应充分搅拌并避光。 7.

银染注意点：

7.1 配置溶液用水与实验清洗用水，均使用电阻率≥１８.２MΩ/CM的超纯水． 7.2 实验用器具，试剂剂瓶均用电阻率≥１８.２MΩ/CM的超纯水洗过． 7.3辅染液中的戊二醛，显影液中的甲醛应临用前加． 7.4银染液应新鲜配置． 7.5银染时因避免强光照射．

7.6请严格按照实验步骤操作，特别是清洗时间与反应时间应严格控制． 7.7实验时禁止用手直接触凝胶，否则会留下手印，应用干净的镊子接触胶．