2017-2018学年高中生物 第一章 无茵操作技术实践 第二节 植物组织培养技术(第2课时)分离特

第二节 分离特定的微生物并测定其数量

1．认识各种微生物形成的菌落特征。

2．学会利用涂布平板法分离、培养微生物，并测定其数量。(重难点) 3．掌握利用选择培养基分离特定微生物的方法。(重点)

微 生 物 的 分 离 1．分离原理 在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。 2．分离方法

(1)平板分离法：包括涂布平板法和混合平板法。能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。

(2)选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。 (3)根据菌落特征初步分离：

①菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

②菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以成为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。

[合作探讨]

探讨1：在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌吗？ 提示：标准的单个菌落中只含有一种细菌。 探讨2：如果要分离厌氧菌，应在什么条件下培养？ 提示：在无氧条件下培养。

探讨3：在选择培养分离微生物的过程中，“选择培养”的培养基按物理性质划分属于什么培养基？为什么？

提示：固体培养基。便于选择、分离所需要的微生物。 [思维升华]

1．涂布平板法与混合平板法的比较 比较 操作 取一定稀释度的样品涂涂布 平板法 布平板 ↓ 用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀 取一定稀释度的样品与混合 平板法 熔化的琼脂混合 ↓ 将与样品混合后的琼脂倒入无菌培养皿 2.选择培养基的选择作用 (1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

1．微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，关于两者的区别下列说法正确的是( )

比较方面 ① 平板划线法 需在无菌条 件下操作 培养基中 不加琼脂 稀释涂布平板法 不需无菌操作 菌液与琼脂混合，共同倒平板 细菌菌落出现在平板表面及内部 先制作琼脂平板后加入菌液 细菌菌落通常仅在平板表面生长 特点 结果 ② 培养基中加有琼脂

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③ ④ 不可计算菌液 中的活菌数 需要接种环 B．③、④ D．②、③

可计算菌液中的活菌数 需要玻璃刮铲 A.②、④ C．①、④

【解析】 平板划线法和稀释涂布平板法都需要进行无菌操作，避免杂菌污染；平板划线法和稀释涂布平板法都使用固体培养基，培养基中都加有琼脂；平板划线法采用接种环或接种针进行接种，而稀释涂布平板法采用玻璃刮铲进行接种；稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，平板划线法不能计算出菌液中的活菌数。

【答案】 B

2．下面是本课题将用到的培养基配方，请根据下表回答下面的问题：

【导学号：67850009】

编号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 含量 1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是________，提供氮源的是________。 (2)绝大多数微生物都能利用________，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解________。

(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？

【解析】 碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

【答案】 (1)葡萄糖 尿素 (2)葡萄糖 尿素

(3)具有。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。

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土 壤 微 生 物 的 分 离 、 培 养 与 数 量 测 定

1．涂布平板法培养和计数土壤微生物 (1)过程：

(2)计数：每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)

2．显微镜直接计数法

(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 (2)血球计数板：血球计数板是一块特制的载玻片。其上有特定面积为1 mm、高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中方格，每个中方格再被划分成16个(或25个)小方格，每个计数室都由400个小方格组成。

(3)操作过程：

①将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物悬液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。

②加样后静止5 min，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。

(4)计算公式：1 mL悬液所含菌体总数＝每小格平均菌体数×400×10×稀释倍数。 3．分离土壤中能分解纤维素的微生物

(1)实验目的：分离以纤维素为唯一碳源的微生物。 (2)培养基配方特点：纤维素是唯一的碳源。

(3)基本步骤：制备培养基―→制备土壤悬液―→接种培养―→观察。

[合作探讨]

探讨1：你认为涂布平板法计数的菌落数与实际活菌数之间存在什么样的关系？ 提示：实际活菌数大于计数的菌落数目。原因是有的菌落不只由一个细菌生长而成。 探讨2：常见的菌数计数的方法有哪些？它们所利用的原理分别是什么？ 提示：(1)显微镜直接计数法。

其原理：利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

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(2)间接计数法(活菌计数法)。

其原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

[思维升华]

1．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

项目 主要 用具 计数 依据 优点 缺点 计算 公式

2.筛选能分解纤维素的微生物流程图

直接计数法 显微镜、细菌计数板 培养基 间接计数法 菌株本身 计数方便、操作简单 死菌、活菌都计算在内 每毫升原液含菌株数＝400×10×每小格平均菌株数×稀释倍数 4培养基上菌落数 计数的是活菌 操作较复杂，且有一定误差 每毫升原液含菌株数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)

1．某同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )

A．2.15×10 C．215

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B．2.15×10 D．21.5

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【解析】 稀释倍数为100.1 mL稀释液的菌落数的平均值为215，则每毫升样品中菌落数就为215÷0.1×10＝2.15×10。

【答案】 B

2．(2016·四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的

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mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为10的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。 该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为___×10个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。 (3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。

【解析】 (1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×10＝1.75×10。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。

【答案】 (1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115

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1．下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是( ) A．微生物培养前，需对培养基进行消毒 B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法 C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度

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D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源

【解析】 微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法而一般不用活菌计数法；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度以便能从中选择出菌落数在30～300间的平板进行计数；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源。

【答案】 A

2．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )

【导学号：67850010】

①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐 A．①③⑤⑦ C．①③⑤⑧

B．②④⑥⑧ D．①④⑥⑦

【解析】 要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。

【答案】 C

3．用涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )

A．平板上的一个菌落就是一个细菌 B．菌落中的细菌数是固定的

C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同

【解析】 当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由2个或2个以上活菌生长而成，因此菌落数往往比活菌的实际数低。

【答案】 C

4．空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)； ②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。 回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

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(2)步骤③中，实验组的操作是________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36—6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

【解析】 (1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。

【答案】 (1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂 (2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间

(3)污染 不正确 课堂小结：

网络构建 核心回扣 1.实验室中分离微生物的方法有平板分离法和选择培养分离，平板分离法常用的有涂布平板法和混合平板法。 2.针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。 3.测定微生物数量的常用方法有涂布平板法和显微镜直接计数法。涂布平板法计数的结果与待测样品中真正的含菌数量相比往往偏 低。 4.涂布平板法培养和计数微生物的流程为：准备实验器材→采集土壤，制备悬液→选择适于分离特定微生物的培养基→接种→培养与观察→计数菌落。 5.涂布平板法计数微生物的公式：每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后

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的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)

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