皮肤致敏试验替代方法研究进展

China Surfactant Detergent & Cosmetics

日 用 化 学 工 业

Vol.49 No.6June 2019

皮肤致敏试验替代方法研究进展

梅承翰1, 2, 3，谭 红1，杨鸿波1, 3，陈蓓蓓1, 3，刘师卜2，刘 婷2

（1. 贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550016；2. 中国食品药品检定研究院，北京 100050；

3. 贵州健安德科技有限公司，贵州 贵阳 550016）

摘要：概述并比较分析了直接肽反应试验（DPRA）、小鼠局部淋巴结试验（LLNA）、KerationSensTM、人细胞系激发试验（h-CLAT）和重组人表皮致敏试验等皮肤致敏试验替代方法，并重点介绍了各替代方法的整合研究情况，提出了皮肤致敏试验替代方法的发展前景。

关键词：皮肤致敏；替代方法；进展；整合

中图分类号：R758.2 文献标识码：A 文章编号：1001-1803 （2019） 06-0393-05DOI：10.3969/j.issn.1001-1803.2019.06.008

Research progress on alternative methods for skin sensitization tests

（1. Guizhou Academy of Testing and Analysis, Guiyang, Guizhou 550016, China; 2. National Institutes for Food and Drug Control,

Beijing 100050, China; 3. Guizhou JAD Technology Co., LTD, Guiyang, Guizhou 550016, China）

MEI Cheng-han1, 2, 3, TAN Hong1, YANG Hong-bo1, 3, CHEN Bei-bei1, 3, LIU Shi-bu2, LIU Ting2

（DPRA）, local lymph node assay（LLNA）, KerationSensTM, human cell line activation test（h-CLAT）and reconstructed human epidermis model（RHE model）sensitization test, were summarized, analyzed and compared. The integration of these alternative methods was introduced, and the development prospects of alternative methods for skin sensitization test were prospected.

Key words: skin sensitization; alternative methods; progress; integrated approaches皮肤致敏（Skin sensitization）即皮肤接触过敏原后所产生的变应性应答，是一种由外源物质引发的IV型过敏反应。过敏性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）作为皮肤致敏的临床表型，在人群中发生率高达15%~20%［1］。因此，皮肤致敏性评价是化学品毒性评价的重要内容之一。传统的皮肤致敏试验主要以豚鼠等作为实验对象，不仅耗时长、成本高、灵敏度低［2］，而且动物使用量较大。近年来随着人们对动物保护和福利的认识逐渐深入，发展和应用动物试验替代方法已成为共识。我国化学品动物试验替代方法开展起步较晚，目前仍以动物试验为主。然而从长远看，发展化学品毒理学安全性评价动物替代

方法势在必行。本文主要从皮肤致敏免疫应答各个阶段的发展演化特点入手，就应答机制、使用局限等方面系统分析，比较目前已有皮肤致敏试验替代方法的优缺点，并重点介绍各替代方法联合应用的研究进展，为进一步促进检验检测实验室采用替代方法用于致敏性评价提供技术参考。

Abstract: In the present study, skin sensitization alternative methods, such as direct peptide reactivity assay

1 过敏性接触性皮炎的致敏机制

过敏性接触性皮炎表现为红斑、水肿、囊泡、渗出，尤其是强烈瘙痒［3］。ACD通常以分子起始事件为开端［4］，一般而言小分子不能直接被免疫系统识别，需与皮肤上的蛋白结合，然后再与MHC II（Major

收稿日期：2018-07-24；修回日期：2019-05-27

基金项目：中 国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题（2017C6）；贵州省科技计划项目（黔科合平台人才［2016］5709）；贵阳国家高

新技术产业开发区管理委员会科技计划项目（GXYF-2017-001）

作者简介：梅承翰（1991-），男，贵州岑巩人，助理工程师，硕士，电话：（0851）88562347，E-mail：ckklmch@sina.cn。通讯联系人：刘 婷，女，助理研究员，硕士，电话：（010）67095155，E-mail：lutyliu@126.com。

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histocompatibility complex II）结合，或直接与MHC II结合［3］。复合物形成后被朗格罕氏细胞或树突状细胞所识别并内化，然后通过淋巴循环系统转移至局部淋巴结并呈递给T淋巴细胞。该过程受到诸如TNF-α， IL-1/13/18等细胞因子和趋化因子调控，促进或抑制朗格罕氏细胞的活化迁移。朗格罕氏细胞移位至淋巴结，便分化和转化成树突状细胞。分化的树突状细胞可将过敏原表位呈递给T淋巴细胞。T淋巴细胞随后分裂和分化并大量增殖。活化的T淋巴细胞可产生如干扰素、IL-2、IL-17等细胞因子，并被吸引至炎症位点，继而使角质细胞凋亡［3］。上述综合效应最终发展成ACD临床表型。此外再次接触相同抗原时，活化的T淋巴细胞可激发迟发型超敏反应［5］。

2 皮肤致敏试验替代方法分类及其特点

2. 1 小鼠局部淋巴结试验（LLNA）

目前，普遍认为LLNA和豚鼠最大值试验仍是皮肤致敏性体内评价实验的金标准。豚鼠最大值试验通过观察皮肤反应而进行定性检测，而LLNA则依据淋巴细胞的增殖对受试物致敏性进行评价。皮肤致敏剂可诱导淋巴细胞增殖［6］，通过氚化胸腺嘧啶脱氧核苷标记法、ATP生物发光法或BrdU酶联免疫法可检测淋巴细胞增殖

［7］

。LLNA在一定程度上可减少动物使用

和提升动物福利水平，但不能完全避免动物使用。此外，LLNA不能很好地区分致敏物和刺激物，且可能出现假阳性或假阴性结果［8］。

2. 2 KeratinoSensTM

/LuSens试验

研究［9］表明Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）是抗氧化应答的主调控因子，并可与Nrf2作用，其对改善氧化应激至关重要。Keap1蛋白包含高活性半胱氨酸残基［10］。小分子与Keap1的活性半胱氨酸残基进行共价修饰，使Keap1从转录因子Nrf2上解离，Nrf2随后在核内聚集，并激活启动子序列中具有ARE（Antioxidant Response Elements）的基因［10］。很多响应致敏剂作用的细胞标志物由Keap1-Nrf2-ARE通路所调控［11］。基于上述理论，研究人

员开发出了KeratinoSensTM和LuSens两种定量测试方法。KeratinoSensTM和LuSens的主要区别在于ARE元件来源，前者源于人AKR1C2（Aldo-keto reductase family 1 member C2）基因，后者源自大鼠NQO1（NAD · 394 ·

发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）指南指出KeratinoSensTM试验的阴性结果可能存疑，因为受试物若选择性与赖氨酸

残基反应也可被评估为非致敏物［12］。KeratinoSensTM/LuSens试验也可能出现假阴性或假阳性结果，并且对含酐的待测物预测存在困难［13］。

2. 3 sensitisation testh-CLAT/U-SENS）试验

（Myeloid U937 skin

h-CLAT/U-SENS试验主要利用皮肤致敏有害结局通路KE3（Key event 3）：树突状细胞可与过敏原相互作用，摄取并呈递过敏原表位至T淋巴细胞。而树突状细胞或单核细胞激活后其细胞表面标志物CD86或CD54会发生相应表达变化［14］。h-CLAT是将待测物暴露于人单核细胞白血病细胞系THP-1，通过检测细胞CD86和CD54的表达变化评估待测物的致敏性。与之类似U-SENS将受试物暴露于人淋巴癌细胞系U937，并检测细胞表面标志物CD86的变化。h-CLAT高度简化，但其对角质化细胞缺乏作用，此外因其灵敏度低，对弱致敏剂预测较差［13］。h-CLAT采用流式细胞术检测，因而可能带来荧光干扰和待测物的细胞毒性干扰［15］。

2. 4 重组人表皮致敏试验

三维重组人表皮模型（RHE模型）由人源性表皮角质细胞组成，该模型于气-液界面培养，因而可直接应用于化学品。据文献［16］报道，RHE模型呈现出与人皮肤类似的代谢能力，这提示RHE模型可代谢pre/pro-半抗原（pre/pro-hapten），并用于评估相

关化学品。目前已见报道的RHE模型有：epiCS®［ 17］、

SenCeeTox®［18］、SENS-IS［19］和EpiSensA［20］等。SenCeeTox®主要监测8个Nrf2依赖基因，而SENS-IS则关注24个Nrf2-依赖基因和41个其他靶标基因。SENS-IS则通过65个靶标检测炎症和细胞保护应答，在对150个化学品测试中，与LLNA相比准确度达到100%［19］。EpiSensA则基于炎症和细胞保护相关基因ATF3（Activating transcription factor 3）、IL-8、DNAJB4（DnaJ homolog subfamily B member 4）和GCLM（Glutamate-cysteine ligase modifier subunit）等进行检测。EpiSensA与LLNA相比，在29个亲脂性化学品测试中，其灵敏度、特异性和准确度分别达到93%，100%和93%；另外在43个亲水性化学品测试中（含11个pre/pro-半抗原），其灵敏度、特异性和准确度分别达96%，75%和88%［20］。

（Nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2）相互（P）H quinone dehydrogenase 1）基因。经济合作与第6期梅承翰，等：皮肤致敏试验替代方法研究进展

专论与综述

2. 5 直接肽反应试验（DRPA）

2004年，Gerberick等［21］提出直接肽反应试验，该法将待测物与谷胱甘肽、半胱氨酸多肽、赖氨酸多肽或组氨酸多肽孵育后，采用HPLC-UV检测未与待测物共价结合的多肽。而后Gerberick等［22］开发了一套基于多肽损耗和LLNA数据的预测模型，并采用库珀统计法评估模型对致敏物的区分程度。研究表明，半胱氨酸多肽1∶10和赖氨酸多肽1∶50模型在多肽比率和无谷胱甘肽方面平衡较好，预测准确度达89%（81个待

［22］

测物）。经过两轮实验室对比验证，结果表明其重

性，如Derek Nexus、Toxtree和TIMES-SS，或完全基于结构片段统计的训练模型，如CASE Ultra、Vega和TOPKAT。

3 皮肤致敏试验替代方法的比较分析

众多研究者致力于开发非动物测试方法用以评估物质（如化学品和化妆品）的致敏性。目前多个体外致敏性评价方法已经被开发出来，如DPRA、h-CLAT、U-SENS以及KeratinoSensTM等。如表1所示，各皮肤致敏试验替代方法特点不一，各有侧重。动物试验稳定、AOP（Adverse outcome pathway）完整、呈系统性应答、技术含量低，然而道德伦理、物种差异性、花费大等局限也很明显。相对而言，动物实验特异性较低而假阳性数量相对较高，且效价评估不够准确并易发生变异。与之相比，体外试验具有花费较小、效率高、重复性好、简单、方差较小、使用人源性材料等优势。然而体外试验也有其缺点，如：人工模拟皮肤致敏过程、AOP事件覆盖不完整、待测物适用范围限制、部分试验与细胞密度相关等。目前对于KE4有害结局通路（T细胞激活）仍没有非动物测试方法。此外动物试验替代方法可提供致敏定量数据，但是单一测试方法仍不足以预测皮肤致敏效力，而多种方法的组合为致敏性预测提供了可能。

现性良好［23］。研究人员将辣根过氧化物酶-过氧化氢（Horseradish Peroxidase and Hydrogen Peroxide，HRP/P）加入多肽孵育体系后，使得DPRA可检测需酶介导激活的pro-半抗原，从而进一步拓展了DPRA的应用范围［24］。

2. 6 定量构效关系（Quantitative structure-activity relationship，QSAR）

基于计算机的非实验测试方法作为更进一步的皮肤致敏评价方法，避免了体内和体外实验，主要包括QSAR和专家系统。该类模型结合物理化学、结构特性和计算机方法等来赋予待测物一个确定分类或生物学活性，如皮肤致敏等毒性终点［25］。此类模型包括亲电子

表 1 皮肤致敏试验各替代方法比较

Tab. 1 Comparison of alternative methods for skin sensitization test

类别优点缺点待测物适用范围有害结局通路

LLNA

A DME、分子起不 能很好地区分致敏物和刺激物可导致

［6］

始事件、应激假阳性、金属假阴性、放射性核快 速、动物使用量少、方法更

固 /液待测物，溶解或

应答、DC细素、环境污染、溶剂对结果影响大、加完善、灵敏度高、定量检

不溶待测物［6］

胞激活、T细无法区分特定类型的超敏反应、不测、便宜

胞激活能完全避免动物使用对 含酐待测物预测存在问题［13］、待测可 溶或可形成稳定的分 子起始事件、准 确度高、可提供待测物无毒

物水溶性问题［26］、代谢能力缺乏［26］、分散体（如胶体、

应激应答性作用浓度范围

悬浮液）一些物质可干扰流式分选系统［26］待 测物水溶性问题［26］子起始事件、、代谢能力缺 可 溶或可形成稳定的分

可 区分致敏性和刺激性待测物、［26］

乏、一些物质可干扰流式分选 分散体（如胶体、应激应答、

预测表现好、剂量依赖性［26］

DC细胞激活悬浮液）系统单 一组分待测物或各组

分配比已知的混合物

准 确度高、操作简单、可批量对 待测物溶解性要求高、代谢能力缺乏、

（100 mmol/L）、不可分子起始事件

化检测、重复性好不能准确预测组分未知的混合物

用于金属化合物和含未知成分的混合物

Ke ratino- SensTM/ LuSensh- CLAT/U-SENS

DPRA

使 用方便、来源广、变异性小、

A DME、分子起

肤需现培养，试验安排灵活性较差，具有皮肤类似的代谢能力、皮

固 体、液体、半固体始事件、应激三 维重组人

气体、喷剂无法检测，无法区别轻微简单、快速、便宜、可一次

应答、DC细和蜡状物表皮模型

刺激物质，有色物质需调整实验协议筛选较多物质、实验条件易

胞激活

控制、可取代动物试验

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4 各类替代方法的整合

替代方法在皮肤致敏潜力预测方面前景广阔，然而单一替代方法目前尚不能完全预测致敏效力［27］。因此，组合多种替代方法成为目前提高预测准确率的一个重要研究方向。目前已有多个非动物方法组合测试策略被提交至OECD，作为皮肤致敏集成测试和评估方法（Integrated approaches to testing and assessment，IATA）的组成部分

［28, 29］

。

Ubrisch等［30］提出了一个基于DPRA、KeratinoSensTM/

LuSens和h-CLAT/U-SENS简单组合法（2 out of 3）。该法采用各替代方法的标准预测模型，若至少两种方法将待测物评估为致敏物，即被定为致敏物。该法至少涵盖两个AOP事件，其局限特定于各个测试方法，如水溶性差的物质适用性降低。该模型在对213个物质的致敏性预测中，与人或LLNA数据相比，准确率分别达到90%和82%。

分层测试策略（Sequential testing strategy，STS）：Kao STS仅依靠DPRA和h-CLAT，对皮肤致敏性和致敏效力进行预测，其涵盖AOP KE1和KE3。STS的局限同样取决于各测试方法，如水溶性差的物质适用性降低。STS与LLNA相比，危害性识别和效力分级的准确度分别达到81%和69%［31］。相较于多数投票法，分层测试策略所需实验项目少，但也因对不同替代方法有数目要求，使得分层测试策略较复杂，此外二者在花费方面相差不大［32］。

集成测试策略（Integrated testing strategy，ITS）：Kao ITS依赖于DPRA、h-CLAT以及DEREK危害预测软件。该方法在致敏强度分级上与LLNA紧密相关，与之相比，准确度达74%。在额外考虑低水溶性物质后，ITS的灵敏度和准确度分别提高到97%（91/94）

和89%（114/128）［31］

。Jaworska等［33］提出了贝叶斯

网络整合测试策略-3，该数据库包括207个化学品的体内/体外数据。在对外部60个物质的LLNA结果预测中，危害性识别准确度达到100%，致敏效力分级（四级）准确度达到89%［33］。ITS-3相对ITS-2而言，准确度及精密度更高，并强化了对致敏效力的 预测。

Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods-SVM（Support vector machine）：该模型应用机器学习方法-支持向量机原理，其对人皮肤致敏危害性结果的预测基于KeratinoSensTM、h-CLAT、DPRA、log P以及OECD工具箱。另外该模型利用h-CLAT、OECD危害预测工具箱和6种物理化 · 396 ·

学性质等对LLNA危害结果进行预测。其中一个两层模型表现最优，对120个LLNA结果的预测准确度达到88%，对87个人数据的预测准确度达81%［34］。

ANN（Artificial neural network）-EC3非线性统计模型含大量体外和计算机参数，涵盖了皮肤致敏AOP KE1-3［35］

。该模型运用3种体外方法（SH蛋白反应性测试、ARE方法和h-CLAT）对LLNA EC3值进行预测。DPRA和KeratinoSensTM可分别用来替代SH蛋白反应性测试和ARE方法［27］

。此外，很多将待测物物理化学性质及QSAR预测结论添加为额外参数的ANN模型建立起来［27］

。Joint Research Centre-CCT（Classification trees consensus）：该模型对皮肤致敏危害性预测依赖于物质结构特点和蛋白反应性参数。该CCT含269个有机物体外和化学法数据，约4 500个参数，其准确度、灵

敏度、特异性分别为93%，98%和85%（n=269）［36］

。CCT对皮肤致敏物的识别具有快速、简单、准确度高、灵敏度高等特点，可用于对有明确化学结构的有机物进行皮肤致敏性评估，但对混合物、无机物和天然产物还无法预测。

5 结束语

LLNA、KeratinoSensTM/LuSens、h-CLAT/U-SENS、RHE model及DPRA等皮肤致敏试验替代方法分别依赖于淋巴细胞增殖、Keap1-Nrf2-ARE通路、免疫细胞表面标志物、人造皮肤和多肽消耗等，从而评估化学品的皮肤致敏性。皮肤致敏试验替代方法具有操作相对简便、重复性好、省时等特点，但因其AOP不完整等局限而在预测准确率方面仍存在一定的问题。皮肤致敏试验替代方法的组合旨在依靠多个不同类型的替代方法，以弥补或规避各自方法的局限，主要有2 out of 3、STS、ITS、ANN、CCT和SVM等。组合替代方法虽尚不能覆盖AOP全过程，但相较于单一测试方法有效提升了预测准确度，效果类似或稍好于LLNA，此外对于危害性识别表现与各动物试验替代方法十分类似。多种替代方法联合运用，并结合计算机模型加以评估待测物的致敏性，有望推广开来并最终取代动物试验。

随着科学技术水平的不断提升和人民群众的广泛关注，提升动物福利水平已深入人心。各国或地区对动物试验替代方法研究持续加大投入，可以预见，动物试验替代方法必将更加完善，方法也将陆续迭代。由此，皮肤致敏试验替代方法将朝着高灵敏度、高准确度和快速的方向不断发展。

（Majority voting approach）第6期梅承翰，等：皮肤致敏试验替代方法研究进展

专论与综述

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（编辑：张 静）

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（编辑：杨 旭）

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