SN免疫沉淀方法中文

免疫沉淀

*试剂:

1. 裂解缓冲液终浓度:

50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 用的时候加蛋白酶抑制剂。

配制10 mL 裂解缓冲液，需

1 M Tris pH 7.4 0.5 ml

5 M NaCl 0.3 ml

0.5 M EDTA 20 L

10 % Triton X-100 1 ml

加无菌Q水到 10 ml；或补水到10 ml后过滤除菌；再加蛋白酶抑制剂；

另外再配10 ml无菌缓冲液，只是不加Triton X-100，用于最后一步洗涤。

2. 50 % (v/v) protein A or G – Sepharose bead

3. 抗体

4. 阴性对照（可选）

*试验步骤:

注意: 所有的溶液必须预冷，整个操作在4 °C或者冰上操作。

1．细胞裂解液的制备:

I.粘附型细胞培养 Adherent cell culture a. 将组织培养皿放在冰上;

b.将培养液从培养皿中吸走，用预冷的PBS冲洗细胞;

c. 在组织中加入预冷的裂解液

d.*一般直径10 cm，长满80-90%细胞的培养皿中加900 L裂解液，一般含有

0.5-2107 个细胞。其他类型的培养容器，一般加入裂解液覆盖到整个培养表面；

e. 用细胞刮刮下细胞, 将含有细胞的裂解液转移至匀浆器中 ，轻轻振荡3秒，在冰上

放置15-30 min;

f. 将含细胞的PBS于4 C，16,000 g 离心15 min；

g.将上清转移至新的1.5 ml离心管中，不要搅动沉淀

II.悬浮型培养细胞 Suspension cell culture 1. 将细胞悬浮液在15或者50mL带盖的锥底离心管中400 g, 4°C, 离心5min，将离心管置于冰上

2. *一般来说，每一次免疫沉淀要求1m L 裂解溶液中含 0.5-2x 107 细胞

3. 吸去上清.

4. 将细胞重悬于与培养液体积相同的PBS中，用吹打的方法使细胞混匀，然后按照步骤1、2的方法除去PBS

5. 按1 ml/0.5-2x107 cells 的比例加入预冷的裂解液，用中等的速度在混合器上振荡3 s混匀

6. 在冰上放置15-30min 后将悬液转移至1.5ml 离心管中

7. 将细溶液4 C，16,000g 离心15min.

8. 将上清转移至新的1.5 ml离心管中，不要搅动沉淀。

免疫沉淀：

1．处理Protein A/G珠子：将100 l枪头剪去尖头，将装有珠子的管子充分颠倒混匀，迅速取20 l 50 % Protein A 或 Protein G琼脂糖珠悬浮液，加入已有1 ml PBS或无Triton X-100的裂解缓冲液中，10000 g 离心30 s，去掉上清；

2．加入细胞裂解液及抗体（5 L 多克隆抗血清或 5 g 多克隆抗体或1-2 g 单克隆抗体）;

**Protein A Sepharose一般用于兔子来源的抗体

**Protein G Sepharose 一般用于小鼠来源的抗体

3. 用非特异性抗体做一个对照(如免疫前血清)，如果没有，就算了；

4. 颠倒3-4次混合悬液，在旋转仪中4 C 孵育1-2 h;

5. 4 C，10000 g 离心30 S;

6. 吸去上清（留上清保存）;

7. 每管沉淀中加入1 ml 含蛋白酶抑制剂的裂解液，来回颠倒3-4次，混匀;

8. 4 C ，10000 g离心30 S，吸去上清;

9. 重复步骤6、7 一次，洗涤珠子；

10. 用0.5 ml不含Triton X-100的裂解液）洗涤一次，这一次要小心用不同枪头吸，尽量去除珠子以外的液体;

11. 最后的产物应该是结合了抗原的琼脂颗粒，免疫沉淀物加入20 µl 2SDS-上样缓冲液，在沸水中煮10 min，10000 g离心30 S，小心吸取上清，-20 C 保存。